玉米赤霉烯酮对大鼠睾丸支持细胞凋亡蛋白释放的影响及NAC的保护效应

薛画眉， 郭宏元， 王光光， 邹　辉， 袁　燕， 顾建红， 刘学忠， 刘宗平，2， 卞建春，2

(1.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009)

玉米赤霉烯酮(zearalenone，简称ZEA)在全世界动物饲料和人类粮食中普遍存在，它主要是由镰刀菌污染而产生的一种非甾体雌激素类霉菌毒素[1]。据报道，玉米及饲料中ZEA的超标能够引起公猪性欲下降，血清中睾酮含量急剧降低，导致睾丸的病理性萎缩，精子发生障碍，甚至出现雌性化等病变[2]。睾丸支持细胞(sertoli cell，简称SC)在雄性动物精子发生过程中发挥着不可或缺的作用，精子的发生障碍与睾丸支持细胞受损密切相关。睾丸支持细胞是众多环境污染物作用于雄性生殖系统的靶细胞[3]。靶向破坏睾丸支持细胞将导致生精细胞快速、大量非生理性死亡[4]。因此，研究ZEA对睾丸支持细胞的损害作用及其机制，对揭示ZEA雄性生殖毒性机制具有重要作用。本试验以不同浓度的ZEA处理大鼠原代睾丸支持细胞24 h，观察ZEA对睾丸支持细胞线粒体凋亡蛋白Cyt C、AIF释放的影响和NAC对ZEA引起的睾丸支持细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达变化的影响，为揭示ZEA的雄性生殖毒性机制及ZEA中毒的防控提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　试验动物

18～21 d 清洁级Wistar大鼠(由扬州大学比较医学中心提供)。

1.2　主要试剂

玉米赤霉烯酮，购自美国Sigma公司；胎牛血清(FBS)、DMEM/F-12培养基等试剂，购自美国Gibco公司；胰蛋白酶等试剂，购自美国Amresco公司；L-谷氨酰胺、青链霉素等试剂，购自美国Boston Biomedical公司；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡试剂盒，购自美国BD公司； Bax、Bcl-2、Cyt C、AIF、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9等单克隆抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG，均购自美国CST公司；硝酸纤维素膜，购自美国Pall Corporation公司； BCA蛋白浓度测定试剂盒，购自中国碧云天生物技术研究所；预染蛋白分子量标准和ECL化学发光底物检测试剂盒，购自美国Thermo公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3　大鼠原代支持细胞的分离与培养

取18～21 d Wistar雄性大鼠，脱颈处死后，无菌操作取出双侧睾丸，置于预冷的无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS)中并转移至超净工作台内操作。用预冷的PBS将睾丸冲洗3遍后，将睾丸置于直径100 mm的玻璃平皿中，用眼科镊撕去周围脂肪组织及精索，再用眼科剪和眼科镊小心剥去白膜及内部较大血管，并用眼科镊轻轻将曲细精管拉散，置于0.25%胰蛋白酶溶液中，密封后在水浴摇床中于150 r/min 37℃消化15 min至组织碎块呈线索状，加入等体积含血清PBS溶液终止消化，800 r/min、4 ℃ 离心10 min。弃去上清液体，加入0.5%胶原酶溶液，密封后在水浴摇床中于150 r/min 37 ℃消化15 min，至酶液呈黏液状，加入等量含10%FBS的DMEM/F-12培养基终止消化，用100目的网筛进行过滤，将滤液于800 r/min、4 ℃离心 10 min。离心后用DMEM/F-12培养基重悬，重复清洗3次即可，于5%CO2、37 ℃条件下进行培养。对支持细胞的纯化采用低渗处理法[5]，细胞培养24 d后，吸去培养基，用PBS清洗1次后，加入pH值为7.4的20 mmol/L Tris-HCl 处理3 min，吸去处理液，用PBS清洗3次，加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F-12培养基继续培养。

1.4　细胞染毒和线粒体及胞浆中AIF、Cytc C蛋白的制备

以不同浓度(0、5、10、20 μmol/L)ZEA处理睾丸支持细胞24 h后，用0.25%胰酶消化5 min，离心收集细胞不少于1.0×107个(1 200 r/min，5 min，4 ℃)，用4 ℃预冷PBS将细胞洗涤2次。加入300 μL Mito-Cyto Buffer重悬细胞，将细胞悬液移入玻璃匀浆器中，研磨80次(4 ℃冰上操作)。将匀浆液转移至4 ℃预冷的1.5 mL EP离心管中，离心(12 000 r/min，10 min，4 ℃)，沉淀即为线粒体，上清为胞浆蛋白；将上清收集至1.5 mL EP离心管中。沉淀中加入 100 μL 线粒体裂解缓冲液，于冰上裂解30 min，离心(12 000 r/min，10 min，4 ℃)，收集上清，即得线粒体蛋白，用BCA法测胞浆蛋白及线粒体蛋白浓度，-80 ℃保存备用。

1.5　NAC对ZEA致睾丸支持细胞凋亡的影响

以每孔1.0×105个细胞的密度接种于六孔板中，添加NAC(0、20 μmol/L ZEA，100 μmol/L NAC，20 μmol/L ZEA+100 μmol/L NAC)处理24 h后，用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒检测SC细胞凋亡情况。分别设空白组(未加染料)、PI单染组、FITC单染组和处理组(PI和FITC双染)。预先将10×Binding Buffer 加DDW稀释成1×Binding Buffer，备用；用0.25%胰酶消化3 min，收集细胞(1 500 r/min，5 min，4 ℃)预冷1×PBS洗涤细胞，离心后加入100 μL 1×Binding Buffer 重悬细胞，加入AnnexinV-FITC和PI各5 μL单独或联合作用，37 ℃避光反应15 min，200目尼龙网过滤，在1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

同样方法添加NAC处理24 h后(分组同上)，收集染毒后的睾丸支持细胞，用预冷的PBS洗涤2次，用细胞裂解液冰浴裂解细胞30 min，超声波细胞破碎仪裂解30 s，12 000 r/min 离心10 min取上清，用BCA法进行蛋白定量，-80 ℃ 保存备用，以测定调控凋亡蛋白Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-9和cleaved-Caspase-3等的表达量。

1.6　Western Blot法检测凋亡相关蛋白的表达

用蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测以上保存样品的凋亡相关蛋白Cyt C和AIF的释放量及Caspase-3、Caspase-9的蛋白表达水平，同时检测Bcl-2、Bax蛋白表达水平。

蛋白样品上样10 μL/孔，Bench Marker 5 μL，其余孔内加10 μL 1×Loading Buffer，浓缩胶140 V、20 min，分离胶 110 V、100 min，根据marker指示，确定停止时间。置于电转液中，转膜120 V，90 min。用5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST洗2次，吸尽液体后，加入稀释好的一抗(表1)，4 ℃孵育过夜；隔日回收一抗，用TBST洗涤5次，每次5 min，加入稀释好的二抗，室温孵育2 h，用TBST洗涤5 次。

表1　一抗稀释比例及所用稀释液

用ECL检测液发光显影定影。

1.7　数据处理与统计分析

2　结果与分析

2.1　ZEA对睾丸支持细胞线粒体AIF和Cyt C释放的影响

用0、5、10、20 μmol/L ZEA处理睾丸支持细胞24 h后，与对照组相比，随着ZEA浓度的增加，胞浆中AIF和Cyt C的释放量增加，线粒体中AIF和Cyt C的表达量减少。分析灰度值见图1。结果显示，与对照组相比，线粒体中Cyt C表达量呈现出 5 μmol/L ZEA处理组显著下降(P<0.05)和10、20 μmol/L ZEA处理组极显著下降(P<0.01)；各染毒组线粒体中AIF表达量均极显著下降(P<0.01)；胞浆中Cyt C呈现出 10 μmol/L ZEA处理组显著上升(P<0.05)和20 μmol/L ZEA处理组极显著上升(P<0.01)；10、20 μmol/L ZEA处理组胞浆中AIF表达量呈极显著上升(P<0.01)，呈现“剂量-效应”关系。

2.2　NAC对ZEA致睾丸支持细胞凋亡的影响

用100 μmol/L NAC预处理睾丸支持细胞30 min后，用20 μmol/L ZEA作用睾丸支持细胞24 h，流式细胞术检测细胞凋亡率。图2结果显示，与20 μmol/L ZEA处理组相比，NAC与ZEA共处理组R5象限凋亡细胞数量明显减少。与ZEA单独处理组相比，NAC与ZEA共处理组凋亡率极显著降低(P<0.01)。

2.3　NAC对ZEA致睾丸支持细胞Bax和Bcl-2蛋白表达调控

用100 μmol/L NAC预处理睾丸支持细胞30 min后，用20 μmol/L ZEA作用睾丸支持细胞24 h，用Western Blot法检测Bax、Bcl-2蛋白表达变化情况见图3。结果显示，与20 μmol/L ZEA单独处理组相比，100 μmol/L NAC与 20 μmol/L ZEA联合处理组Bcl-2/Bax值有极显著升高(P<0.01)。

2.4　NAC对ZEA致睾丸支持细胞Caspase-3、Caspase-9蛋白活化的调控

用100 μmol/L NAC预处理睾丸支持细胞30 min后，用20 μmol/L ZEA作用睾丸支持细胞24 h，用Western Blot法检测cleaved-Caspase-9、cleaved-Caspase-3蛋白表达变化情况。图4结果显示，与20 μmol/L ZEA单独处理组相比，100 μmol/L NAC与20 μmol/L ZEA联合处理组cleaved-Caspase-9、cleaved-Caspase-3表达量极显著下降(P<0.01)。

3　讨论

Cyt C是由亚铁血红素和多肽组成的一种可溶性色素蛋白，作为线粒体呼吸链中传递电子的载体，与富含不饱和脂肪酸的线粒体内膜外侧的磷脂结合，呈点状分布，在生理条件下限制其自由穿透线粒体外膜。凋亡发生时，线粒体中的细胞色素C将被释放到细胞浆中，激活caspase级联蛋白，加剧凋亡的进行，释放的细胞色素C活化Caspase-9，进一步激活凋亡家族中的关键性蛋白Caspase-3。ZEA诱导人类肝细胞发生caspase依赖的线粒体介导的凋亡，其中活性氧(reactive oxygen species，简称ROS)的产生在线粒体畸变和Cyt C的释放中起着关键作用[6-7]。本研究发现，ZEA处理睾丸支持细胞能够导致线粒体中Cyt C释放到胞浆中。AIF在凋亡发生过程中调控线粒体膜的通透性，位于线粒体外膜内。在线粒体遭到损伤刺激时，转移至胞浆和细胞核中，参与凋亡进程。Yu等研究证实，ZEA通过调控RAW264.7中AIF的释放而介导caspase非依赖凋亡的进程，在ZEA诱导山羊间质细胞发生凋亡中AIF起到了关键性作用，Cyt C一般涉及caspase依赖的细胞凋亡，而AIF和End G在caspase非依赖凋亡中发挥着重要作用[8-10]。本试验中，AIF随ZEA浓度的升高，在线粒体中的表达量降低，在相应的胞浆中的表达量递增。说明caspase依赖和caspase非依赖性凋亡信号通路共同调节ZEA诱导睾丸支持细胞凋亡的发生。

NAC在致神经元死亡的体内和体外模型中均起到保护作用[11]。GHhosh等研究表明，在黑色素瘤细胞中，用ROS特异性清除剂NAC阻断ROS的生成，可抑制ROS诱导的Bax表达量上升和Bcl-2表达量下降[12]。在败血症和急性肺损伤模型试验中，口服NAC(150 mg/kg)的适当剂量能够降低肺组织中Caspase-3的表达[13]。本试验结果表明，抗氧化剂NAC能够明显抑制因ZEA暴露引起的睾丸支持细胞凋亡发生；Bcl-2/Bax值升高，cleaved-Caspase-9和cleaved-Caspase-3的蛋白表达量均降低，与相关研究存在一致性[14]。NAC显著降低睾丸支持细胞因ZEA引起的氧化损伤，线粒体得到了有效保护。Bcl-2基因产物大量存在于活性氧产生的关键场所——线粒体内膜，Bcl-2的上调使线粒体膜免于脂质过氧化的损伤；Bcl-2的表达量回升，可以有效地抑制Bax、cleaved-Caspase-9和cleaved-Caspase-3等凋亡执行蛋白表达；Bax的下调，使线粒体膜的通透性维持稳态，从而阻断ZEA激活线粒体凋亡通路，延缓ZEA引起的睾丸支持细胞凋亡发生。综上所述，NAC可以对ZEA诱导的睾丸支持细胞的凋亡发生起抑制作用。

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