健康成人皮肤对十二烷基硫酸钠刺激反应的反射式共聚焦显微镜特征分析

江文才　谈益妹　江长清　徐雅菲　秦鸥

200443上海市皮肤病医院皮肤与化妆品研究室

十二烷基硫酸钠（sodium lauryl sulphate，SLS）是公认的皮肤刺激反应阳性对照物，广泛用于化妆品安全性评估和职业性皮肤病刺激成分筛查［1⁃3］。研究显示，SLS以不同浓度、刺激时间以及刺激方式作用于人体后，不同性别和年龄人群会发生不同的反应［4⁃6］。但上述研究中不同性别和年龄之间反应性强弱的结论不完全相同，其原因可能与SLS诱发的皮肤反应临床特征不典型，以及临床医生评判尺度存在差异有关。我们用反射式共聚焦显微镜（RCM）观察0.1%和0.5%SLS刺激后，男女性以及18～40岁和41～60岁人群皮肤角质形成细胞变化及炎症反应情况，分析性别和年龄对SLS诱导的刺激反应的影响；同时，初步探讨RCM在客观评价皮肤反应中的应用价值。

对象与方法

一、对象

124名健康受试者参加本研究。入选标准：受试者无过敏史，自愿参加本研究，具有良好的依从性。排除标准：近1个月内使用免疫制剂、抗组胺类药物或非甾体抗炎药物；哺乳期或妊娠妇女患有炎症性皮肤病未愈者；试验部位有瘢痕、色素、萎缩、鲜红斑痣或其他瑕疵而影响试验结果判定者。本研究通过上海市皮肤病医院医学伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

二、方法

根据预实验结果，将SLS（纯度＞99%，英国Sigma Chemical公司）用蒸馏水分别稀释为0.1%和0.5%。采用美国smartPractice公司生产的直径8 mm圆形Finn Chamber标准芬兰小室斑试器，加样量0.02 ml，应用3M胶带固定。采用封闭斑贴试验方法，将0.1%和0.5%SLS及阴性对照（蒸馏水）同时贴敷于每位受试者背部肩胛骨下距脊柱中央2.0 cm处，贴敷48 h。分别于去除斑试物0.5、24、48 h进行临床评估和RCM检测。皮肤反应评判标准参照《化妆品皮肤病诊断标准及处理原则》实施指南［7］，以“-”和“±”为阴性，“ +～+++”为阳性反应。RCM检测包括采用Block模式拍摄3 mm×3 mm表皮各层和真表皮交界处图像；采用Stack模式随机拍摄4个位点图像（最大深度为150.88 μm，每层厚度4.57 μm，共33层），定性分析RCM图片（0为无，1为有）。将研究对象分为18～40岁和41～60岁组，观察2组以及男女性别间皮肤刺激反应和RCM特征。

三、统计分析

使用统计软件SPSS 17.0。不同组间临床评估结果和RCM特征发生率比较采用χ2检验。临床评判结果与RCM参数之间的相关性采用Spearman相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结　果

失访4人，120人完成全部试验。男61例，年龄（39.02±12.17）岁；女59例，年龄（39.92±12.07）岁，不同性别间年龄分布差异无统计学意义（P＞0.05）。18～40岁和41～60岁组各60例，年龄分别为（28.93±5.17）岁和（50.00±6.61）岁，前者男性31例，女性29例，后者男女各30例，不同年龄组间男女性别分布无统计学差异（P＞0.05）。

一、临床评估

0.1%和0.5%SLS刺激皮肤后不同时间，临床评估阳性反应见表1，阴性对照位点均未出现阳性反应。去除0.1%和0.5%SLS后24 h，男女性之间及18～40岁和41～60岁组间阳性反应率差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

二、RCM特征分析

1.0.1%和0.5%SLS刺激后皮肤RCM特征：见表3、图1。SLS刺激后常见的RCM特征包括角化不全、角质层结构不清、棘层海绵水肿，表皮炎症细胞浸润和真皮乳突毛细血管扩张，偶见表皮微囊肿。去除0.5%SLS后24 h，真皮乳突毛细血管扩张发生率最高达95.0%，其次为表皮炎性细胞浸润为85.0%。同一时间点，0.5%SLS组RCM特征阳性人数高于0.1%SLS组。同时，去除刺激后24 h和48 h，0.5%SLS组角化不全、角质层结构不清、海绵水肿、表皮炎症细胞浸润和毛细血管扩张的发生率均明显高于0.1%SLS组，差异均有统计学意义（P＜0.01），并且0.5%SLS组表皮厚度也显著高于0.1%SLS组（P＜0.05）。去除斑试物后24 h，RCM特征发生率最高，随后下降。

表1　0.1%和0.5%十二烷基硫酸钠（SLS）刺激皮肤后不同时间阳性反应情况［例（%）］

表2　十二烷基硫酸钠（SLS）刺激不同年龄男女受试者皮肤后24 h临床评估结果

表3　去除0.1%和0.5%十二烷基硫酸钠（SLS）刺激后不同时间点反射式共聚焦显微镜主要特征

2.不同性别人群RCM特征：见表4。0.1%SLS刺激去除24 h时，女性角化不全、棘层海绵水肿和真皮毛细血管扩张发生率均高于男性，但差异均无统计学意义（P＞0.05）；0.5%SLS刺激去除24 h时，除女性棘层海绵水肿发生率高于男性（χ2=4.24，P＜0.05）外，其余RCM特征发生率男女之间均相近。不同浓度SLS刺激后，相同年龄组男女之间表皮厚度差异均无统计学意义（P＞0.05）。然而，去除斑试物48 h时，男性RCM特征转阴率明显高于女性，其中，0.5%SLS刺激位点男性角化不全、海绵水肿和表皮炎症细胞浸润转阴率分别为24.6%（15/61）、45.9%（28/61）和 49.2%（30/61），而女性分别为10.2%（6/59，χ2=7.79，P＜ 0.01）、33.9%（20/59，χ2=6.51，P＜ 0.05）和32.2%（19/59，χ2=4.75，P＜ 0.05）。

3.不同年龄人群RCM特征分析：由表4可知，0.1%SLS斑贴试验后，18～40岁人群角质层结构不清、海绵水肿、表皮炎性细胞浸润和毛细血管扩张的发生率均高于41～60岁，但仅棘层海绵水肿发生率在两个年龄组间差异有统计学意义（χ2=4.09，P＜0.05）；0.5%SLS刺激后，两年龄组之间所有RCM特征发生率比较接近，差异均无统计学意义（P＞0.05）。不同浓度SLS刺激后18～40岁和41～60岁两个年龄组人群RCM特征的转阴率基本一致。

4.RCM特征与临床评估结果的相关性：见表5。0.1%和0.5%SLS刺激去除后24 h，RCM特征与临床评估结果之间均具有良好的相关性。其中，0.1%SLS刺激后后，棘层海绵水肿和真皮毛细血管扩张的发生率情况与临床评估结果相关性最高，相关系数均为0.77（均P＜ 0.001）；0.5%SLS刺激后，同样是真皮毛细血管扩张和棘层海绵水肿与临床评估结果的相关性最高（均P＜0.001）。

相较于两者之间良好的相关性，去除斑试物0.5 h后，0.1%和0.5%SLS组表现出2项以上RCM特征的人数比例分别为17.5%（21/120）和51.7%（62/120），比同一时刻临床评估的阳性率［2.5%（3/120）和12.5%（15/120）］更接近去除SLS 24 h后的临床评估结果34.2%（41/120）和85.0%（102/120）。

图1　0.1%十二烷基硫酸钠刺激后反射式共聚焦显微镜皮肤主要特征　1A：角化不全（黄色箭头）；1B：角质层结构不清（红色圆圈）；1C：棘层海绵水肿及炎症细胞浸润（蓝色圆圈代表海绵水肿，红色箭头代表炎症细胞）；1D：真皮毛细血管扩张；1E：微囊肿（黄色圆圈）。标尺=50 μm

表4　去除十二烷基硫酸钠（SLS）后24 h健康成人皮肤反射式共聚焦显微镜特征

表5　去除十二烷基硫酸钠（SLS）后24 h健康成人皮肤反射式共聚焦显微镜特征与临床评估结果的相关性分析（rs）

讨　论

2002年Hicks等［8］首次应用RCM观察到高浓度SLS刺激后，不同肤色人群角化不全、角质层结构不清、海绵水肿以及真皮乳突和表皮炎症细胞浸润等RCM特征之间存在差异，并且与组织病理学检测结果高度一致。随后Astner等［9⁃10］进一步证实RCM在刺激性接触性皮炎鉴别诊断中的应用价值。本研究中观察到的RCM主要特征与上述研究基本一致，但表皮微囊肿发生率低于上述研究结果，可能与我们所用的SLS浓度较低有关。研究同时显示，0.5%SLS组临床评估结果和RCM参数的阳性率高于0.1%SLS组，且两者之间具有良好的相关性，显示RCM是一种评估SLS诱导的皮肤刺激反应工具。另外，除去0.1%SLS后0.5 h，仅3例发生阳性皮肤反应，而至少1种RCM参数阳性者高达48例，RCM阳性参数＞2项的受试者中77.8%（14/18）去除斑试物后24 h，临床评估转化为阳性。同时伴有角化不全和表皮炎症细胞浸润的24例受试者，均转为红斑反应阳性者。由此可见，RCM可用于早期预测低浓度化学物诱发皮肤刺激反应的风险。

SLS斑贴后不同时间，RCM相关参数的主次地位也不断变化。早期RCM主要特征包括表皮炎症细胞浸润、毛细血管扩张和角化不全；24 h后，真皮毛细血管扩张、表皮炎症细胞浸润和棘层海绵水肿成为主要的阳性参数；48 h时，棘层海绵水肿和表皮炎症细胞浸润恢复最快，而真皮毛细血管扩张和角质层结构不清恢复的速度最慢。

关于性别对SLS诱发皮肤反应的影响结论不尽相同，Robinson［6］和杨丽洁等［11］研究认为，男性相对于女性对不同浓度刺激物更加敏感。本研究临床评估结果显示，男女性在0.1%和0.5%SLS刺激后，皮肤阳性反应率差异均无统计学意义（P＞0.05）。不同性别人群中除了0.5%SLS刺激后棘层海绵水肿发生率女性高于男性外，其他RCM指标男女间差异均无统计学意义。可见0.1%和0.5%SLS诱发的皮肤刺激反应无性别差异，与Meding［12］研究结果相一致。但在SLS诱导的皮肤反应自然转归过程中，男性RCM参数的转阴率均高于女性，提示男性受试者外界化学物刺激后的皮肤修复能力强于女性。

有研究显示，青年人群比老年人群对外界刺激更容易发生阳性反应［6，13］，本研究临床评估结果显示，0.1%和0.5%SLS刺激后，18～40岁和41～60岁人群之间皮肤刺激反应发生率差异无统计学意义。

综上所述，性别和年龄因素对0.1%和0.5%SLS诱导的皮肤反应的发生和发展无明显影响。RCM在客观评估皮肤刺激反应中具有良好的应用价值。

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