非小细胞肺癌移植瘤侵袭组织中血清蛋白的分布

白玉勤 吴 　宝 张 　龙刘晓辉 其木格 刘帅莹韦学磊 王　徽

（1. 赤 峰学院医学院病理学教研室，内蒙古　赤峰 　024000；2. 赤 峰学院附属医院病理科，内蒙古 　赤 峰 　024005；3. 赤 峰学院医学院组织胚胎学教研室，内蒙古 　赤 峰 　024000；4. 赤峰学院附属医院输血科，内蒙古　赤峰　024005；5. 赤峰学院附属医院神经内科，内蒙古 　赤 峰 　024005）

肿瘤微环境是影响肿瘤发展和转移的关键因素[1]。许多研究采用病理检查的石蜡切片进行评估分析肿瘤微环境，但传统标本制备过程中的固定和脱水等影响肿瘤微环境的精准分析[2-3]。由日本山梨大学大野伸一教授研制开发的活体冷冻技术(in vivo cryotechnique，IVCT)是活体状态下冷冻固定动物靶器官，揭示了血液流动状态下的组织细胞结构，克服了传统标本制作方法血流中断带来的弊端[4]。我们利用IVCT技术不仅在小鼠肝脏、肾脏、卵巢等器官上清晰观察到血清蛋白(serum proteins)，如Albumin、IgG、IgA、IgM等，而且在异种移植人非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC) 模型上首次清晰观察到血清蛋白分布，避免了传统标本制作方法导致的人工假象(artifacts)，提出了肿瘤间质及细胞外基质的血清蛋白分布与其相对分子质量密切相关[5-6]，研究发现在A549移植瘤周边和中心区域的血清蛋白如Albumin、IgG1、IgM的分布不同[6]，为了进一步研究A549移植瘤周边区域(侵袭组织)血清蛋白分布情况，本研究再次利用冻存的A549细胞，在日本山梨大学医学部动物实验室制作模型，在大野教授指导下制备冷冻标本，探讨移植瘤侵袭组织血清蛋白分布与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和表皮生长因子受体(epidermal g rowth f actor r eceptor，EGFR)的关系。

1　材料与方法

1.1　实验动物及移植瘤模型的建立

1.1.1实验动物 本动物实验经日本山梨大学动物保护与使用委员会批准。雄性BALB/c品系(BALB/c-nu/nu)裸鼠20只，购于日本SLC株式会社，鼠龄为7～8周，动物模型建立和饲养均在日本山梨大学动物实验室SPF条件下的超净工作台中进行。

1.1.2肺癌细胞系 非小细胞肺癌A549细胞由日本东北大学生物医学研究所提供，在日本山梨大学医学部解剖分子教研室的细胞培养室常规传代培养[7]，细胞培养于含20%小牛血清的RPMI-1640培养液中。

1.1.3肿瘤移植 运用细胞培养移植法，先进行A549细胞培养并传代，收集约5×106个细胞接种到裸鼠背部靠近头部皮下，接种后观察肿瘤的生长情况，于第2周开始使用游标卡尺在体外分别测量瘤体长径和宽径，采用的体积计算公式为1/2×(长径)×(宽径)2，待肿瘤体积达到1 000 mm3时进行病理形态学观察。

1.2　仪器和试剂

1.2.1主要仪器设备 牙科电钻，磁力搅拌器，低温冰箱，转轮切片机，白色透明湿盒，五片直立瓶，罗纹口玻璃瓶，防脱片，显微镜。

1.2.2主要试剂 多聚甲醛，丙酮，异戊烷，丙烷，液氮，干冰。鱼明胶，购于Sigma公司；羊抗鼠血清蛋白(albumin)、免疫球蛋白G1和M(IgG1、IgM)、兔抗人VEGF和EGFR单克隆抗体、羊抗兔IgG，均购自迈新生物技术开发公司；兔抗羊IgG，购于Vector Laboratories；二氨基联苯胺(3´，3-diaminobenzidine，DAB)试剂盒。

1.3　标本的制备

带有移植瘤的裸鼠用乙醚麻醉，剪开背部皮肤暴露移植瘤进行活体冷冻固定并制备标本[8]。用-196 ℃液氮致冷的异戊烷-丙烷冷冻液(-193 ℃)冷冻固定移植瘤，在液氮里用牙科电钻取下肿瘤组织后，移到-80℃干冰预冷的2%多聚甲醛-丙酮液中进行冷冻置换[6]。冷冻置换是固定在2%多聚甲醛-丙酮液的冷冻标本逐渐升温从-80 ℃到室温的过程。移植瘤冷冻置换后用聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物或石蜡包埋剂包埋，进行冰冻或石蜡切片，显微镜下观察。

1.4　免疫组织化学染色

石蜡标本3 μm连续切片后贴附于含MAS的防脱载玻片(购于日本Matsunami Glass)。一部分切片进行苏木精-伊红染色，另一部分切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化，最后蒸馏水水化后用PBS冲洗，用于免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)染色。IHC采用亲和素-生物素-过氧化物酶(ABC)法。首先用1%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶活性，2%鱼明胶溶液封闭。PBS漂洗3次，分别滴加一抗羊抗鼠血清蛋白(albumin)、 免 疫 球 蛋 白 G1和 M(IgG、 IgM)(Bethyl Laboratories，Montgomery，TX，USA)，兔抗人VEGF和EGFR单克隆抗体，4 ℃冰箱孵育过夜。PBS冲洗后滴加与第一抗体种属匹配的二抗兔抗羊IgG或羊抗兔IgG，室温孵育1 h。DAB显色，采用苏木精进行细胞核淡染，梯度酒精脱水后中性树胶封片，显微镜下观察。每次染色均设空白对照(PBS)和自身阳性对照。自身阳性对照是在同一切片上与检测的目的物对照比较。如albumin在血管腔内应为阳性，IgG1和IgM在某免疫细胞浆或血管腔内应为阳性，EGFR和VEGF在红细胞膜或某梭形细胞浆应为阳性。

1.5　判断标准

根据免疫组化染色程度分为强阳性(+++)、中度阳性(++)和弱阳性(+)，无着色为阴性(-)。在连续切片上对NSCLC(包括血管、肿瘤周围结缔组织、肿瘤间质、肿瘤细胞外基质、免疫细胞)的albumin、IgG1和IgM蛋白表达程度进行统计，VEGF和EGFR蛋白免疫组化染色在胞膜或细胞浆呈棕色判断为阳性，无着色为阴性。

2　结果

2.1　Albumin、IgG1和IgM在NSCLC移植瘤侵袭组织的分布

A549移植瘤侵袭组织HE染色和albumin、IgG1、IgM蛋白免疫组织化学染色结果见图1。可见在HE切片上NSCLC侵袭组织观察到扩张的血管及血管内流动的红细胞，癌细胞核及清晰的核仁，丰富的细胞浆，并且细胞与细胞间连接比较紧密。Albumin免疫组化染色在血管、癌周围结缔组织、细胞外基质及肿瘤间质呈强-中度阳性。IgG1免疫组化染色在血管和肿瘤周围结缔组织呈中度阳性，在肿瘤间质和细胞外基质呈弱阳性。IgM免疫组化染色在血管和肿瘤周围纤维结缔组织呈中度阳性，但是在肿瘤间质和癌细胞外基质呈阴性。IgG1和IgM在免疫细胞中呈强阳性，半定量分析见表1。

图1　A549移植瘤侵袭组织HE染色和albumin、IgG1、IgM蛋白免疫组织化学染色图片(×200)

表1　NSCLC侵袭组织albumin、IgG1和IgM表达的半定量分析

2.2　VEGF和EGFR蛋白在NSCLC移植瘤侵袭组织的分布

VEGF免疫组化染色(图2A和2B)在肿瘤周围纤维结缔组织和间质内某梭形细胞膜阳性表达，血管内皮细胞和红细胞膜也呈阳性表达，癌细胞浆呈细颗粒状阳性表达。EGFR蛋白(图2C和2D)在肿瘤周围纤维结缔组织和间质内某梭形细胞质和细胞膜阳性表达，血管内皮细胞和红细胞膜阳性表达，但是癌细胞浆和膜未见VEGF蛋白表达，呈阴性。

3　讨论

动物切除组织制作病理学标本过程中，通过化学固定和酒精脱水步骤，通常会导致组织收缩、分子易位和抗原封闭[9，11]等，产生人工假象。IVCT技术是瞬间冷冻固定组织和细胞，防止了传统化学固定的弊端。本研究采用A549细胞异种移植模型，通过IVCT 技术制备的NSCLC标本，观察HE染色的侵袭组织的组织学特点，并进行albumin、IgG1和IgM免疫组化染色分析。IVCT技术制备标本的HE形态同样观察到均匀红染的细胞外基质，没有因传统标本制备方法而导致细胞收缩的缝隙[6]。清晰观察到利用IVCT制备NSCLC侵袭组织的albumin、IgG1和IgM免疫组织化学染色分布，半定量分析进一步说明了移植瘤侵袭组织不同分布，在肿瘤细胞外基质的免疫组织化学分布有可能与它们的分子量密切相关。另外，还有可能与血清蛋白的电荷及血管构造有关，反映了NSCLC侵袭组织肿瘤细胞间复杂相互作用导致局部微环境的改变。

图2　A549移植瘤侵袭组织VEGF和EGFR蛋白免疫组织化学染色分布

VEGF是作用最强的促血管形成因子之一，它可以通过与其特异性受体结合引起一系列的信号转导，释放多种细胞因子与生长因子，促进血管内皮细胞增生和血管形成，增加血管通透性，并且参与肺癌浸润和转移[12]。我们研究了BI6-BL6黑色素瘤细胞移植瘤组织IgM免疫组化表达与线粒体功能的关系[13]，并且在Lu99和Lu65移植瘤组织中讨论了VEGF、vWF和IgM三者的关系[8]，得出了肿瘤细胞胞浆VEGF强阳性区域的细胞外基质中IgM免疫组化染色阴性，证明了Lu99和Lu65移植瘤组织VEGF强阳性区域的血管壁不能透过大分子量IgM，发现了NSCLC组织的功能性血管。本研究中明确提出NSCLC侵袭组织癌细胞VEGF和EGFR蛋白表达，发现了VEGF蛋白在癌细胞浆、间质梭形细胞、血管内皮细胞及红细胞膜或浆均阳性表达，但是EGFR蛋白在A549移植瘤侵袭组织癌细胞浆或膜阴性表达，在间质梭形细胞、血管内皮细胞及红细胞膜或浆阳性表达。图1和图2说明了A549移植瘤侵袭组织细胞外基质血清蛋白质albumin、IgG1、IgM的免疫组化染色分布与VEGF和EGFR表达无关。据文献报道，Weiss等[14]认为EGFR蛋白表达与microRNA-128b调节密切相关。并且EGFR参与多种信号途径促进血管形成和肿瘤细胞增殖。Nicholson等[15]研究分析了1985年到2000年发表的有关EGFR与癌预后的文献，不同的研究其结果也不同，产生这些差异可能与标本数量和缺乏标准化的免疫组织化学判定标准等有关。我们通过IVCT技术，清晰显示了A549移植瘤侵袭组织EGFR 蛋白分布，证明了EGFR表达与肿瘤细胞侵袭无关。

综上所述，在异种移植A549细胞模型上，IVCT技术制备的标本采用免疫组化染色分析albumin、IgG、IgM、VEGF和EGFR蛋白分布，清晰观察到albumin、IgG1 和IgM在移植瘤侵袭组织细胞外基质的不同分布，有可能与其分子量有关，与VEGF和EGFR蛋白分布无关。

(感谢日本山梨大学医学部解剖分子组织学教研室大野教授大力支持)

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