17β—E2联合顺铂对人卵巢癌细胞裸鼠移植瘤的影响

邹路遥　林国志

[摘要] 目的 研究17β-E2单用或联合顺铂（DDP）作用于人卵巢癌细胞株 HO-8910裸鼠移植瘤的影响。方法 建立人卵巢癌HO-8910裸鼠皮下移植瘤模型，随机分成6组：A组（生理盐水组）、B组（低剂量17β-E2）、C组（高剂量17β-E2）、D组（顺铂5 mg/kg）、E组（低剂量17β-E2+顺铂）、F组（高剂量17β-E2+顺铂），每组5只。观察各组人卵巢癌裸鼠移植瘤的生长情况、各组裸鼠的体重改变。 结果 A组、B组、C组、D组、E组、F组裸鼠体重均增加，B组、C组、D组、E组、F组治疗后裸鼠体重均比A组体重轻，但各组差异无统计学意义。B组、C组、D组、E组、F组移植瘤体积、瘤重均明显减少，其中E组、F组治疗后比单独用药体积变化明显，两组相比较，F组移植瘤体积、瘤重均更小。 结论 高剂量17β-E2联合顺铂更具有抑制人卵巢癌裸鼠移植瘤生长的作用。

[关键词] 17β-E2；顺铂；卵巢癌；移植瘤

[中图分类号] R737.31 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）04-0039-04

[Abstract] Objective To study the effects of 17β-E2 alone or combined with cisplatin on the growth of transplanted tumor of human ovarian cancer cell line HO-8910 in nude mice. Methods Subcutaneously transplanted tumor model of human ovarian cancer HO-8910 was established and randomly divided into 6 groups： group A（normal saline group）， group B（low dose 17β-E2）， group C（high dose 17β-E2）， group D（cisplatin 5 mg/kg）， group E （low dose 17β-E2+cisplatin）， and group F（high dose 17β-E2+cisplatin）， with 5 mice in each group. The growth of transplanted tumor of human ovarian cancer in nude mice in each group was observed， and the changes of body weight of nude mice in each group were observed. Results The body weight of nude mice in group A， group B， group C， group D， group E and group F was increased， and the body weight of nude mice in group B， C， D， E and F after treatment was all lighter than that in group A， but there was no statistical significance in each group. In group B， group C， group D， group E and group F， the volume of transplanted tumor and the weight of tumor were decreased significantly， and the volume change in group E and group F after treatment was more significant than that of administration alone. Compared between the two groups， the tumor volume and tumor weight in group F were both lower. Conclusion High dose of 17β-E2 combined with cisplatin has a better inhibitory effect on the growth of transplanted tumor of human ovarian cancer in nude mice.

[Key words] 17β-E2； Cisplatin； Ovarian cancer； Transplanted tumor

卵巢癌是婦科常见的恶性肿瘤，因为早期无明显症状，大部分女性查体发现卵巢癌时，病情已处于中晚期阶段，超过5年生存率的卵巢癌患者仅有40%[1，2]。手术加术后辅助化疗是主要治疗手段。患者术后卵巢去势导致雌激素水平低下而出现绝经综合征，严重影响患者的术后生命质量。激素替代治疗（Hormone replacement therapy，HRT）是改善卵巢去势妇女雌激素低下症状、提高生命质量的最佳方法。但上皮性卵巢癌患者术后应用HRT能否促进肿瘤复发尚存在争议。本文通过建立人卵巢癌HO-8910裸鼠皮下移植瘤模型，观察不同剂量17β-雌二醇（17β-E2）单独或与DDP联合应用对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的作用，从而为卵巢肿瘤防治研究提供新方法和开创新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究采用人卵巢癌细胞株HO-8910，来自于上海细胞生物所，是人上皮性肿瘤-卵巢浆液性囊腺癌。SPF级别裸小鼠BALB/c/nu/nu由中国医学科学院动物研究所提供，均为雌性，4周龄，体重14～15 g，在无菌屏蔽环境中饲养，动物许可证号是SCXK（京）20060-0008。

1.2 方法

卵巢癌细胞株HO-8910，常规方法复苏，调整细胞悬液浓度为2×107/mL。每只裸鼠后背部皮下均接种1处，每处0.2 mL，含有4×106个卵巢癌细胞。接种1周左右，裸鼠移植瘤长到约米粒大小时开始实验，用剪耳做标记法将30只裸鼠随机分成6组，每组5只：A组（对照组，连续21 d皮下注射生理盐水，每日剂量为0.2 mL）、B组（每日皮下注射1.3 μg低剂量17β-E2，每次剂量0.2 mL，连续21 d）、C组（每日皮下注射高剂量17β-E2 3.9 μg，每次注射剂量0.2 mL，连续21 d）、D组（每日腹腔注射顺铂5 mg/kg，每次0.2 mL，1次/7 d，共4次）、E组（每日皮下注射低剂量17β-E2 1.3 μg，连续21 d，在低剂量17β-E2治疗的第1、7、14、21 d腹腔注射顺铂5 mg/kg，每次均为0.2 mL）、F组（每日皮下注射高剂量17β-E2 3.9 μg，连续21 d，在高剂量17β-E2 治疗的第1、7、14、21 d腹腔注射顺铂5 mg/kg，每次均为0.2 mL）。每只裸鼠接种一点，观察裸鼠移植瘤的生长情况。

1.3观察指标

监测移植瘤接种成活率，给药期间每4日用游标卡尺测量移植瘤长（a）、宽（b），按体积（V）=πab2/6计算瘤体积，绘制移植瘤的生长曲线，每4天称取裸鼠体重1次。末次给药24 h后，采用脱臼法处死裸鼠。完整剥出瘤组织，并测量移植瘤重量。同时观察瘤块情况及有无周围组织浸润。并计算裸鼠移植瘤的抑瘤率。

公式=×100%。 1.4 統计学处理

应用SPSS10.0 for Windows统计软件包进行数据相关分析和统计，计量资料用（x±s）表示，采用t检验及单因素方差分析、双因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组裸鼠一般情况及体重改变

卵巢癌细胞接种于裸鼠身上后，接种的裸鼠移植瘤成活率均为100%，所有裸鼠的后背部皮下均长出瘤体。早期移植瘤表面光滑，为圆形或椭圆形的实体瘤，后期逐渐形状不规则，表面凹凸不平，可见很多的血管网交替连接，多个结节融合一起。个别瘤体表面有出血坏死。各组裸鼠一般情况均较好，饮水进食正常，反应灵活，活动正常，体重增加。用药前后各组裸鼠的体重无明显变化，经统计学分析，差异无统计学意义（表1）。治疗后两两比较，用药组裸鼠体重均比A组体重轻，各组比较，差异无统计学意义。

2.2 各组裸鼠肿瘤体积变化

治疗过程中，A组移植瘤生长迅速，其体积一直大于其他各组的体积，可以认为不同时间点测量体积的差异有统计学意义（P<0.05）。治疗结束后，各组肿瘤体积与A组肿瘤体积比较，差异有统计学意义（P<0.05）。D、E、F组与A、B、C组相比较，差异有统计学意义（P<0.05）。D组、E组比较差异有统计学意义。D组、F组比较，差异有统计学意义（P=0.000）。F组体积明显小于E组，差异有统计学意义（P=0.000<0.05）。见表2。

2.3 不同药物对裸鼠移植瘤生长抑制效果

各治疗组瘤重均比A组轻，结果表明各治疗组移植瘤的瘤重均轻于A组。而且E组、F组的瘤重比D组轻。A组抑瘤率为0.00，B组抑瘤率为40.91%，C组抑瘤率为43.99%，D组抑瘤率为50.84%，E组抑瘤率为55.94%，F组抑瘤率为67.70%。见表3。

3讨论

卵巢癌是女性生殖器官疾病中比较常见的肿瘤，据统计其发病率位居第3位。但因卵巢癌致死者却占首位，严重威胁妇女的生命。手术难以治愈，一般需要化疗来延续治疗。联合化疗一般以铂类为主，在多数卵巢癌中起明显作用，但因长期的副作用，如骨髓抑制、患者耐药、停药后复发等，使很多患者无法接受。激素替代疗法可以人为地补充外源性雌激素，体内激素水平得以改善，许多卵巢癌手术后的更年期综合征症状得以改善。正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤及卵巢恶性肿瘤组织中均有雌激素受体存在[3]。17β-雌二醇可于胎盘、卵巢等中提取。17β-雌二醇也用于生物试验，其干扰未成熟的或已经切除卵巢的大鼠阴道分泌物，显微镜下阴道分泌物呈现由角化细胞组成。国外学者[4]在试验中首次发现ERβ，提出原来的ER定义为ERα，其在卵巢恶性肿瘤中呈现高表达，而ERβ主要在良性肿瘤及人的正常上皮细胞中呈现高表达。在上皮性卵巢癌中较正常卵巢，ERα呈上升趋势，ERβ呈下降趋势[5]，在浆液性和黏液性卵巢癌中ER呈现高表达，所以，卵巢癌患者接受激素替代辅助治疗是否有效果，以及在激素替代治疗作用下机体内是否发生一些生物化学反应等一系列问题尚需研究。

为探讨卵巢癌患者术后应用激素替代是否复发及对患者生存的影响，有文献[6]随机在373例患者中选取78例患者采用激素替代治疗，结论是在卵巢癌的复发率及生活质量等方面，应用激素替代与未应用激素替代者相比无统计学差异。美国医学会杂志于2002年刊出的基础干预研究中，其结论关于使用激素治疗有很大的影响力[7]。研究报道中妇女绝经后使用雌激素/孕激素，两者应用使血脂谱发生明显变化[8]。结果发现，应用雌激素后妇女骨折的风险减少，而深静脉血栓、脑血栓患病率增加，此结论与雌孕联合应用组一致。与对照组相比，在直肠癌、冠心病、结肠癌、乳腺癌中单独使用雌激素，雌激素的危险方面没有显著统计学意义[9]。相关文献[10]选择绝经前后134例卵巢癌患者，在手术后8周分为两组，进行前瞻性随机对照分析研究，其目的是研究雌激素是否影响卵巢癌的复发，以及对患者的生存质量是否有影响。卵巢癌患者一组接受安慰剂治疗，另一组接受结合性雌激素治疗，每日0.625 mg，结果表明62例激素替代患者中统计出59例，其中卵巢癌复发32例（54%）。卵巢癌复发后总生存期为35个月，不影响生活质量的生存时间2年左右。总生存期与不影响生活质量的生存时间无明显差异。结论表明激素替代治疗不会干扰患者的生存质量。

17β-E2主要是由卵巢分泌产生的一种性激素，维持外阴、阴道、子宫、输卵管的生理作用，促进这些器官的生长和发育成熟。在临床中，雌激素作为药物，可用于预防骨质疏松、冠心病、老年痴呆症等老年病，主要用于治疗围绝经期及更年期综合征。人们已经关注到17β-E2促进肿瘤生长、导致肿瘤形成等潜在的副作用。在1998年进行的一项前瞻性研究，其结果是：患者应用雌激素10年以上者，发生卵巢癌的风险增加1/4。然而6项研究中，激素替代治疗10年者仅有1项研究发现卵巢癌发生危险明显增加。总之，卵巢癌发生危险增加1/4，差异无统计学显著性，因此可以认为卵巢癌的发生与雌激素应用无关。关于雌激素在人体内的影响一直存在争论。一些人认为雌激素在晚期前列腺癌、乳腺癌中应用有效[11]。故有必要在此方面加强研究，有效利用雌激素的作用，在临床治疗中得以应用，减少和避免不良的副反应发生。有研究[12，13]对人卵巢癌细胞株OVCAR-3进行体外培养，研究17β-E2对其是否有增殖或抑制作用，结论是生理浓度下17β-E2降低细胞增殖，加速细胞凋亡。但是目前关于17β-E2对人卵巢癌的试验研究相对较少。

此实验中构建裸鼠移植瘤模型是关键。裸鼠移植瘤模型的影响因素，包括以下几点：（1）裸鼠：SPF级别，无菌环境下生长，熟悉裸鼠的生活习性，食物、水等均要达到标准。（2）卵巢癌细胞数量：形成裸鼠移植瘤，细胞数量至少为1×106个，最好细胞数量达到5×106个，成瘤率才高。瘤细胞量过低，不易于成瘤，少于1×105个仅使个别裸鼠成瘤[14]。因此在本实验中，接种正处于对数生长期的卵巢癌细胞，接种在裸鼠后背部皮下，每只0.2 mL，接种的卵巢癌细胞数量为4×107个细胞，接种后可见裸鼠后背部均有结节状突起，裸鼠移植瘤成瘤率100%，伴随着实验研究，瘤组织逐渐增大。（3）17β-E2用量：依据人和动物等效剂量换算法[15]，人每天用量×2.6×10-3=裸鼠每天用量，以及17β-E2临床用药剂量为1.5 mg/d、0.5 mg/d。因而计算出治疗组中每只裸鼠接种17β-E2剂量为0.0039 mg/d、0.0013 mg/d。A组中每天给予注射生理盐水0.2 mL。晚上裸鼠的雌激素水平最高，因此每天19点按时在裸鼠身上注射药物。

本实验通过成功构建卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型，于裸鼠移植瘤上注射不同药物，比较治疗前后裸鼠的体重、移植瘤的瘤体积、瘤重及抑瘤率。试验后发现各组裸鼠体重均有增加，各用药组治疗后裸鼠体重均比A组体重轻，但各组无统计学意义。各治疗组移植瘤体积均减小，各治疗组间瘤重均有明显减少，其中低劑量17β-E2+DDP、高剂量17β-E2+DDP治疗后比单独用药体积变化明显，两组相比较，高剂量17β-E2+DDP移植瘤体积、瘤重均更小。因此得出结论，各治疗组与A组相比，均有抑制卵巢癌移植瘤生长的作用，而且高剂量17β-E2抑瘤效果更明显。17β-E2联合顺铂抑瘤效果优于单独用药，其中高剂量17β-E2 联合DDP抑瘤作用最明显。本研究结果表明不同剂量17β-E2单用能抑制移植瘤生长，高剂量17β-E2联合顺铂更能有效抑制移植瘤的生长。因此，17β-E2联合顺铂对卵巢癌的临床治疗有指导意义。

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（收稿日期：2017-02-20）