尿素在透明标本制作中的应用❋

卢明智 李长征 曾雨冰 杨为祝 张宇灵

(福建中医药大学, 1 临床医学2014级, 2 解剖学教研室, 福州 350122)

实验发现，利用尿素混合物进行浸泡，可以使生物标本变透明。日本科学家使用这种方法处理小鼠的脑切片，成功制作了完全透明而且不影响荧光信号的小鼠全脑标本[1]。在透明标本制作领域中，通常使用碱透明法、甘油透明法、改进碱甘油透明法及冬青油透明法[2-5]。而尿素透明法建立在传统甘油透明法的基础上，对透明方法进行了较大的改良，使得透明标本的制作在效果良好的情况下更好地保证了组织的完整性和致密程度，大大缩短透明时间，提高了标本制作的成功率, 现报道如下。

1 实验

1.1 实验材料

蟾蜍、生理盐水、茜素红染剂、尿素、曲拉通(Triton X-100)、甘油、广口瓶、止血钳、镊子、手术剪、手术刀。

1.2 实验前准备

将蟾蜍处死，剥皮，去除内脏，冲洗血液，放入10%甲醛溶液固定1周后备用。透明液的配置：尿素240 g、10%甘油1 L、Triton X-100 1 ml，混合备用。染液的配置：1%氢氧化钾溶液100 ml，加入0.1%茜素红3～4滴，现配现用，避光保存。

1.3 制作方法和步骤

将固定完成的蟾蜍放入透明液中，1周左右，当透明液变黄时及时更换，待标本半透明至可见骨骼后取出。用生理盐水冲洗，洗去浮液。将蟾蜍移入茜素红染液中，完全浸没，避光染色3～4 d，待椎骨完全着色后即可取出。用生理盐水洗去浮色后，放入30%甘油中，待肌肉颜色脱去。甘油按照80%、90%、100%的浓度对标本进行梯度透明，每个梯度浸泡2～4 d，使标本内的水完全脱去后放入纯甘油溶液中保存。

2 结果

经过此法制作出的透明标本，除骨骼外基本完全透明，骨骼染色清晰可见，形态完整，未出现塌陷变形，结构紧密，极大程度上减轻了传统透明标本法中出现的结构软烂变形现象。肌肉组织富有弹性，呈胶冻状，且无气泡产生(图1)。

3 讨论

3.1 尿素透明剂的作用

尿素具有一定的溶解蛋白质的作用。高浓度尿素可使蛋白质的多肽主链及其氨基酸侧链的结构改变，从而令蛋白质溶解，使组织透明。而Triton X-100作为非离子表面活性剂, 具有破膜作用，而且在溶液中性质稳定，不易受强电解质影响。通过破坏细胞膜的屏障作用，使得甘油更易渗透进组织中，同时由于甘油具有亲水性，当甘油渗透到组织中，可与组织中的水结合，改变生物组织的折射率，从而使其变得透明[5]。故甘油中混入尿素透明剂会比单纯的甘油混合液透明效果更好，透明时间更短。

图1 蟾蜍透明标本

3.2 此法优点

3.2.1 标本完整，透明度高，不易产生气泡 实验结果证明，相对于使用碱预透明再用甘油透明的方法，使用尿素混合物透明的标本，柔软有弹性，呈胶冻状，极大提高了标本的完整性，结构不易散架，且不易产生气泡，标本的美观性好。

3.2.2 操作简单，影响因素少 单纯使用甘油透明，需要用不同梯度浓度的甘油进行阶段透明，使用水杨酸甲酯透明则不仅要各级乙醇脱水，还需要二甲苯等透明剂初步透明，材料损耗大，耗时长，操作繁琐且危险，而碱透明法对透明标本本身组织结构的损害严重。与此相比，使用尿素混合物透明则操作较为简单，较大程度上避免了制作过程中对标本组织的损害。

同时，传统透明标本染色法中使用的碱溶液透明，其碱溶液受温度的影响较大，而改良法则受温度影响较小，使得受到的影响因素较少，且易于控制，成功率高。