生防菌F170062发酵液理化性质研究及粗提活性初探

张晓慷，王海利，张新刚

(山东省农药科学研究院，山东 济南　250100)

植物病害是影响农作物高产、优质的重要因素之一，每年因植物病害给农作物造成的损失无法估量。我国是世界上人口最多的国家，防治植物病害，促进农作物增产，保障粮食安全对我国具有十分重要的意义。传统的植物病害防治措施以施用化学农药为主，但化学农药存在残留污染、诱导病菌抗性增强、造成环境污染、危害人体健康等诸多缺点[1-2]。生物农药和生物防治以其低残留、低毒、低抗性及环境友好等优点，逐渐被世界很多国家关注和推广，成为解决植物病害最富前景的措施[3-4]。

黄瓜灰霉病是由灰葡萄真菌侵染引起的，主要发生于黄瓜生育期的病害，若防治不当，一般会造成10%～70%以上的减产，现已成为我国温室大棚中黄瓜减产的主要病害之一[5-6]。同时，该病菌还能危害茄子、番茄、大葱、青椒、韭菜等多种经济作物和粮食作物，所以，开发高效、低毒、可靠的灰霉病防治药物具有十分重要的现实意义。

本课题组从土壤中筛选到一株对黄瓜灰霉病具有生物防效的菌株F170062，本文对其发酵液的稳定性进行了研究，同时对发酵液中的抑菌物质的粗提活性进行了初步探索。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1供试菌株

供试菌株：生防菌株F170062，本实验室保存。

靶标菌株：黄瓜灰霉病菌，由本实验室分离鉴定并保存。

1.1.2培养基

发酵培养基：1%可溶性淀粉、2%葡萄糖、2.5%花生粉、0.1%牛肉膏、0.4%的酵母浸粉、0.2%NaCl、0.005%K2HPO4，水1000 mL，调节pH值=7.2，分装于250 mL三角瓶中，每瓶约80 mL，在121℃下湿热灭菌25min备用。

PDA培养基：37 g马铃薯葡萄糖琼脂培养基、1000 mL水，加热煮沸溶解，分装于500 mL三角瓶中，每瓶约300 mL，在121℃下湿热灭菌25min备用。

1.2　方法

1.2.1发酵粗提液的制备

取生长有F170062菌的斜面接种于发酵培养基中，在28℃，转速220 r/min的恒温摇床中培养4d。而后将发酵液在4000 r/min的离心机中离心10min，上清液经0.22μm的滤膜过滤，作为发酵粗提液，置于4℃的冰箱中保存备用。

1.2.2发酵粗提液抑菌活性的测定

采用有毒介质法测定发酵粗提液对供试菌株的抑菌活性。(1)取20μL发酵粗提液加入到已灭菌的培养皿中；(2)在培养皿中定量加入20 mLPDA培养基，摇晃均匀；(3)待培养基凝固后，在培养基上接种黄瓜灰霉病菌饼，放置在18℃培养箱中培养4 d，后取出采用十字交叉法测定病原菌菌落直径，并计算抑菌率，公式如下：

抑菌率=(对照菌落直径-处理后菌落直径)×100/(对照菌落直径-菌饼直径)

如非特殊说明，本文所有试验均设3个重复。

1.2.3发酵粗提液粗提活性试验样品处理

将20 mL发酵粗提液平均分成3份，分别调pH值为3、7、10，后再将每个pH值发酵粗提液再分成3份，分别作正丁醇萃取，乙酸乙酯萃取、沸水15min加热处理，萃取完成后，把有机相部分和水相部分进行分离，对每个样品进行编号，编号如表1所示。

表1　F170062粗提液样品编号

对处理后的样品进行减压旋转蒸发，蒸发掉各自的溶剂后向样品中加入100μL甲醇，再加入与原发酵液同体积的水，恢复到原来的体积，同时回调到原发酵液pH值。

1.2.4发酵粗提液粗提活性试验样品纸片的制备

在无菌室中，将湿热灭菌处理过的纸片依次在样品中浸取1～2min，后取出，按编号顺序放置在含有黄瓜灰霉病菌孢子的PDA培养基，每个样品重复两次，以不放置处理样品的含有黄瓜灰霉病孢子的PDA培养基为对照，在18℃培养箱中培养4 d，后查看结果。

1.3　粗提液稳定性测定

1.3.1热稳定性测定

将发酵粗提液在30、50、70、90、100℃下水浴1 h，冷却后，以未处理的发酵粗提液及无菌水为对照，测定对黄瓜灰霉病的抑菌活性。

1.3.2酸碱稳定性的测定

测定发酵粗提液pH值后，用盐酸和氢氧化钠将粗提液pH值调节至2、4、6、8、10、12，在室温下放置2 h，后将pH值调回粗提液原pH值，以未处理的发酵粗提液及无菌水为对照，测定对黄瓜灰霉病的抑菌活性。

1.3.3紫外稳定性的测定

将发酵粗提液加入到无菌培养皿中，在超净工作台中，25W紫外灯下，距离10 cm照射1、3、5、7、9 h，以未处理的发酵粗提液及无菌水为对照，测定对黄瓜灰霉菌的抑菌活性。

1.3.4粗提液加入量

定量向培养基中加入10、20、50、100、150、200、300、400、500μL粗提液，以未处理的发酵粗提液及无菌水为对照，测定对黄瓜灰霉病的抑菌活性

2　结果与分析

2.1　粗提液的热稳定性

将粗提液在30、50、70、90、100℃下水浴1 h，冷却后以未处理的发酵粗提液和无菌水为对照测定抑菌活性，结果如表2所示。

表2　F170062粗提液的热稳定性

由表2可知，当发酵粗提液在30℃、50℃下加热1 h后，抑菌活性较原液相比并没有发生明显变化，但是当温度上升到70℃时，温度对粗提液中的抑菌物质有明显影响，此时，对黄瓜灰霉病菌的抑菌率较未处理液降低了约10%，且随着温度的继续升高，抑菌率呈明显下降的趋势。这说明，粗提液中的抑菌物质在低温下有较好的稳定性，对黄瓜灰霉病菌能够保持较强的抑制作用，但是在受热温度较高时，抑菌物质抑菌效果明显变差，抑菌效果降低。

2.2　粗提液的酸碱稳定性

将菌株F170062发酵粗提液在不同pH值条件下放置2 h后，调回原始的pH值，测定抑菌活性，结果如表3所示。

表3　F170062粗提液的酸碱稳定性

由表3可知，F170062发酵粗提液在酸性和碱性条件下，其抑菌活性并没有发生明显变化，特别是在强酸和强碱的环境中，其抑菌物质的活性与未处理液相比，仍能保持较强的抑菌率。这说明，F170062粗提液的酸碱稳定性较好，能够适应酸碱环境的变化。

2.3　粗提液的紫外稳定性

无菌条件下将F170062发酵粗提液用25W紫外灯照射不同时间后测定抑菌活性，结果如表4所示。

表4　F170062粗提液的紫外稳定性

如表4所示，经紫外线照射1、3、5、7、9 h后，F170062发酵粗提液的抑菌活性与未处理液相比没有发生显著变化，这说明，F170062发酵液中的抑菌物质有较强的紫外稳定性。紫外稳定性对抑菌物质的开发与使用至关重要。农药的施用多在自然条件下进行，如果抑菌物质在紫外线照射下不稳定，药效就会显著降低，影响农药的使用效果[7]。F170062发酵液中的抑菌物质紫外稳定性较好，有着良好的生物农药开发前景。

2.4　粗提液投加量的影响

无菌条件下，分别取10、20、50、100、150、200、300、400、500μL发酵粗提液于培养皿中，以无菌水为对照，通过有毒介质法测定其抑菌活性，结果如表5所示。

表5　F170062粗提液投加量的影响

由表5可知，随着F170062粗提液投加量的增加，对黄瓜灰霉菌的抑制率呈逐渐上升的趋势，抑菌率从24.58%提升到92.50%，当粗提液投加量增加到500μL时，黄瓜灰霉病病菌已无法正常生长，这说明F170062发酵粗提液对黄瓜灰霉病菌有较好的抑菌效果。

2.5　粗提液抑菌物质粗提活性初探

由于发酵粗提液中成分复杂，包括发酵液中未利用完的培养基组分和各种各样的发酵代谢产物，所以为方便后期抑菌物质的提取，采用纸片法探索抑菌物质合适的提取方法，并对发酵液中的粗提活性进行考察，其结果如图1所示。

图1　F170062粗提液纸片法试验结果

由图1可知，编号为6、7、10、15、16纸片周围都有明显的抑菌圈，其中，6：pH值=7 正丁醇萃取相；7：pH值=7乙酸乙酯萃余相；10：pH值=10、正丁醇萃取相；15：pH值=10沸水处理；16：未处理粗提液。试验结果说明以上编号的纸片中含有F170062粗提液的抑菌物质。根据以上试验结果可得出结论：(1)抑菌物质在中性和碱性条件下能够被正丁醇萃取出来；(2)抑菌物质难以被乙酸乙酯萃取出来；(3)抑菌物质在碱性条件下经过沸水15min加热处理后仍具有抑菌活性。

3　结论

通过对F170062菌发酵粗提液的热稳定性、pH稳定性、紫外稳定性、粗提液加入量的考察发现，菌株F170062发酵粗提液在50℃以下有较好的抑菌效果，当温度高于70℃时，发酵粗提液的抑菌活性开始下降，但是发酵粗提液经100℃处理后仍有抑菌活性；发酵粗提液在强酸和强碱的环境下和紫外辐照条件下具有较好的抑菌稳定性，抑菌效果与未处理液相差不大；随着发酵粗提液加入量的增大，抑菌物质对黄瓜灰霉病菌的抑制能力呈逐渐增强的趋势，当发酵粗提液加入量增加到500μL时，黄瓜灰霉病菌已经无法生长了；通过纸片法对F170062发酵粗提液的粗提活性进行初探发现，在中性和碱性条件下发酵粗提液的抑菌物质能够被正丁醇萃取出来，这为以后F170062发酵粗提液中抑菌物质的提取方法的建立奠定了基础。

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