河北省猪腹泻相关病毒的检测及猪流行性腹泻病毒S基因遗传变异分析

张若曦，张　志，顾文源，刘天驹，李　翀，王建昌，李　彬，袁万哲，王玉清，韩庆安*

(1.河北省动物疫病预防控制中心，石家庄 050035； 2.中国动物卫生与流行病学中心，青岛 266032；3.河北出入境检验检疫局技术中心，石家庄 050051； 4.江苏省农业科学院兽医研究所，南京 210014；5.河北农业大学动物医学院，保定 071001)

猪病毒性腹泻是猪场常见疾病之一，主要病原是猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritisvirus, TGEV)和猪轮状病毒(porcine rotavirus, PoRV)。这三种腹泻病毒以单独或混合感染方式引起猪群呕吐、水样腹泻、脱水、逐渐消瘦等临床症状，对仔猪危害较大，可导致仔猪高死亡率，造成养猪业严重的经济损失[1-2]。自2010年以来，我国多省大范围暴发以严重腹泻和仔猪高死亡率为症状的猪腹泻病，在2011年和2012年最为严重，PEDV变异株的流行是导致此次疫情暴发的主要原因[3-4]。在河北地区，2010年开始暴发腹泻疫情，腹泻病高发时期在2011 年至 2012 年间，与其他省份的报道基本一致，而在2013年河北省腹泻病发生率明显回落[5-7]。2013年后，河北省邻近地区腹泻病发生情况略有不同，山东省部分地区腹泻病呈现缓和态势[8-9]，而在山西、辽宁等地腹泻病仍呈现高发生率和高死亡率[10-11]。为摸清当前河北地区猪病毒性腹泻的流行状况和遗传变异规律，2016年4月至2017年2月，本研究采集河北省11个地市无害化处理厂、门诊部和屠宰场发病猪样品，进行PEDV、TGEV和PRoV的流行病学调查和PEDVS基因的遗传变异分析，为河北省猪病毒性腹泻的综合防控提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　流行病学调查和样品采集

2016年4月至2017年2月期间，通过对河北省11个地市的无害化处理厂和门诊部送检的1 855例患猪病例进行背景分析，腹泻发病猪180例。对腹泻发病猪采集小肠组织或小肠内容物用于后续检测。

1.2　主要试剂与设备

TaqDNA聚合酶、dNTPs购自上海生工科技有限公司；磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；猪传染性胃肠炎病毒/流行性腹泻病毒/轮状病毒三重核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)购自中山大学达安基因股份有限公司。

组织研磨仪购自德国Qiagen公司；核酸提取仪购自赛默飞世尔生物科技公司；四通道荧光PCR仪购自西安天隆科技有限公司。

1.3　样品处理和检测方法

取腹泻病料小肠组织样品或肠内容物加1 mL PBS制成组织匀浆，反复冻融3次；5 000 r·min-1离心5 min，取200 μL上清液进行核酸提取。按荧光PCR检测试剂盒说明书配制反应体系并加入模板，利用荧光PCR仪，参照试剂盒说明书设定扩增程序进行荧光RT-PCR，待扩增结束后按说明书进行结果判定。

1.4　PEDV S基因引物的设计与目的片段扩增

以PEDV流行株AJ1102株为参考模板，利用Oligo 6.0软件设计三对用于扩增PEDVS基因的引物(表1)，利用RT-PCR对9份来源不同的PEDV阳性病料扩增S基因，经测序拼接后获得完整的S基因序列。

1.5　PCR产物回收与测序

PCR产物胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；将胶回收产物送上海生工科技有限公司进行测序。

1.6　测序结果分析

通过BioEdit将所克隆获得的S基因与GenBank上发表的33条国内外PEDVS基因推导氨基酸序列进行比对分析(表2)。利用MEGA 7.0程序软件的邻位相接法(Neighbor-joining 法)进行系统进化树的构建，并以Bootstrap 值验证进化树的可信度。利用NetNGlyc 1.0 Server对S蛋白糖基化位点进行预测。

表1PEDVS全长基因扩增序列

Table1TheprimersusedforamplificationofPEDVSgene

名称Primer引物序列(5'-3')Sequence退火温度/℃Temperature片段起止位置Position扩增长度/bpFragmentS-F1S-R1AAGTGGCGCTGTGATTGACAGAAAGAACTAAACCCATTGATA575520376—20393bp22238—22261bp1885S-F2S-R2TTCTTGGCTGTTTTACCTCCTACCCTTCTCGGCGTCAACAACACC606221792—21815bp23360—23480bp1688S-F3S-R3AATGGCCTTGGTACTGTTGATGAACGTGTATTGAAAAAGTCCGAGAAA605823355—23378bp24794—24817bp1462

表2PEDV参考毒株信息

Table2RepresentativePEDVstrainsusedinthisstudy

毒株Strain分离地Collectedarea登录号AccessionNo.毒株Strain分离地Collectedarea登录号AccessionNo.AH2012ChinaKC210145SHQP-YM-2013ChinaKJ196348AH2012-12ChinaKU646831SLO-JH-11-2015SloveniaKU297956AJ1102ChinaJX188454SM98SouthKoreaGU937797Attenuated_DR13SouthKoreaJQ023162Tottori2-JPN-2014JapanLC022792CH-AHHF-2-2012ChinaJX018182USA-IL20697-2014USAKT860508CHGD-01ChinaJX261936USA-Iowa106-2013USAKJ645695CH-HNAY-2015ChinaKR809885USA-Iowa107-2013USAKJ645696CH-JX-1-2013ChinaKF760557USA-Iowa303-2014USAKR265827CV777BelgiumAF353511USA-KS-2013USAKJ184549FL2013ChinaKP765609USA-Michigan252-2014USAKR265822GD-AChinaJX112709USA-Minnesota52-2013USAKJ645704JS2008ChinaKC109141USA-Minnesota61-2013USAKJ645705JS-HZ2012ChinaKC210147USA-Ohio126-2014USAKJ645702MF3809SouthKoreaKF779469USA-Texas435-2014USAKR265834OH851USAKJ399978VirulentDR13SouthKoreaDQ862099PC21AUSAKR078299YC2014ChinaKU252649PEDV-LYGChinaKM609212

2　结　果

2.1　病毒性腹泻流行病学调查

对全年送检的1 855例患猪病例进行统计分析，其中腹泻病例共180例，占全年总送检病例的9.70%。对腹泻病样品检测结果进行统计，发现25份病料有PEDV检出，检出率为13.89%；9份病料有PoRV检出，检出率为5.00%；TGEV仅在3份病料中检出，检出率为1.67%(表3)。对河北地区11地市检出结果进行分别统计，结果显示，各地市PEDV和TGEV检出情况与河北省基本一致，但少数地市PoRV的检出率偏高(图1)。综合以上结果表明，当前PEDV仍是引起河北地区猪群腹泻病的主要病毒性病原。

对腹泻病样品按猪年龄分类进行结果统计，结果显示，PEDV在仔猪和育肥猪中均有较高检出率，在仔猪中检出率最高，可达19.28%；TGEV和PoRV则在育肥猪中检出率最高，分别达6.90%和13.79%(表3)。

图1　河北省11地市腹泻相关病原调查结果Fig.1　Investigation of diarrhea related pathogen from Hebei province

对腹泻病样品按采样点来源进行结果统计，结果显示，PEDV在无害化处理厂检出率高达30.00%，而TGEV和PoRV没有检出；另外，PEDV和PoRV在门诊部均有一定检出，检出率分别为17.60%和6.40%，TGEV检出率仅为1.60%(表3)。

在全年所检样品中，PEDV和TGEV发生率均在寒冷的冬春季节最高，在盛夏季节发生率最低；而PoRV发生率在春夏、夏秋季节变换时最高，在盛夏和深冬发生率较低(图2)，表明在河北地区，春冬季节仍是病毒性腹泻病原多发季节，而夏季较少发生。

在检出腹泻相关病原的样品中，PEDV单独感染率最高，达54.70%，PoRV单独感染率为22.11%，TGEV单独感染率为10.54%。在所检测具有腹泻相关病原的样品中，PEDV和TGEV共感染率为5.91%，PEDV和PoRV共感染率为6.17%，TGEV和PoRV共感染较少发生，共感染率仅为0.51%(图3)。所检样品中未发现3种腹泻相关病原共感染情况。以上结果表明，PEDV引起的腹泻疾病主要以单独感染为主。

表3河北地区腹泻相关病毒检测情况

Table3ThepositiverateofPEDV,TGEVandPoRV

检测病原Detectedpathogen总体检出率/%(检出数)Totaldetectionrate(number)不同类型猪群检出率/%Detectionrateofdifferenttypesofpigs不同采样点检出率/%Detectionrateofdifferentsamplingpoints仔猪Piglet保育猪Nurserypig育肥猪Fatteningpig无害化处理厂Innocuoustreatmentplant门诊部ClinicPEDV13.89(25)19.282.7817.2430.0017.60TGEV1.67(3)0.000.006.900.001.60PoRV5.00(9)3.612.7813.790.006.40

图2　不同月份腹泻相关病原调查结果Fig.2　Investigation of diarrhea related pathogen collected from different months

图3　腹泻相关病原混合感染情况Fig.3　Investigation of diarrhea related pathogen of single infection and co-infection

2.2　PEDV S基因序列分析

S蛋白被认为是PEDV关键毒力蛋白，其遗传变异往往造成毒株毒力改变[12-13]。本研究选取来源不同的9份PEDV病料对S基因进行扩增并进行测序，得到9株PEDVS基因序列，并上传至GenBank(登录号：MG132631～MG132639)。经相似性比较分析，发现本研究所获得的9条S基因核苷酸序列相似性为96.8%～100.0%，推导氨基酸序列相似性为96.4%～100.0%。与GenBank上发表的33条国内外PEDVS基因推导氨基酸序列构建遗传进化树(图4)，发现进化树主要分为G1、G2和INDELs三支，本研究所获得的9条S基因全部位于G2上。G2这一大支又可以分为 G2a和G2b小支，本研究所获得的9条S基因序列中，HB1601(MG132631)和HB1603(MG132632)株位于G2b分支，与美国流行毒株遗传关系较近；HB16123(MG132637)、HB16134(MG132638)和HB16135(MG132639)株位于G2b分支，与中国流行毒株遗传关系较近；HB1604(MG132633)和HB1605(MG132634)株以及HB1619(MG132635)和HB1622(MG132636)株位于G2a分支，与当前国内外流行毒株遗传关系较远。

图4　河北地区PEDV毒株S基因氨基酸序列遗传进化树Fig.4　Phylogenetic analyses of PEDV strains based on the amino acid sequences of S gene

将所得到的S基因与PEDV变异毒株AH2012进行氨基酸序列比对，发现所测9条S基因氨基酸序列均有多处突变。其中，处于G2b分支上的毒株突变位点较多，达38～39个；处于G2a分支上的毒株与CV777相似突变位点较多，达14个(表4)。此外，HB1601和HB1603在382—383位氨基酸(TY)发生独特缺失，HB1619和HB1622株在234—236位有三个独特氨基酸插入(SAW)(表4)。经NetNGlyc 1.0 Server软件预测AH2012株S蛋白有67处潜在糖基化位点，其中29处为NXT/S糖基化位点。对所获得的9条S基因氨基酸序列进行糖基化位点预测，发现多条S基因序列因氨基酸突变导致缺失或引入预测糖基化位点，其中HB1601株缺失一处预测NXT/S糖基化位点，HB16123、HB16134和HB16135株增加两处预测糖基化位点，HB1604和HB1605株分别增加一处预测糖基化位点(表4)。与33株参考序列相比，所获得9条S基因氨基酸序列均发生多处独特氨基酸突变，其中HB1601、HB1603、HB1605、HB16123、HB16134和HB16135株在S蛋白核心抗原展示区域均有独特突变发生(表4)。

3　讨　论

PEDV、TGEV 和PoRV是引起猪腹泻病的主要病毒性病原，均以腹泻症状为主要临床特征，难以区分。河北地区自2010年开始暴发猪群腹泻病，在2011年和2012年疫情最为严重，2013年疫情趋于稳定[7, 14]。本研究对2016年2月至2017年4月河北地区送检临床样品进行发病情况统计和PEDV、TGEV 和PoRV病原学检测。调查结果显示，当前河北省猪群腹泻病发生率较2010—2013年有明显缓解。不同于国内南方地区全年腹泻病均呈高发态势[6, 15-18]，春冬季节为河北地区病毒性腹泻病多发季节。通过对腹泻病料调查，发现PEDV仍是腹泻病的主要病毒性病原，同时还发现少数地区正在流行PoRV，甚至个别地区PoRV是腹泻病的主要病原，这提示PoRV在河北省大面积流行的风险正在提高。

2011—2015年间，全国各地PEDV流行毒株以引起仔猪高发病率和高死亡率为主要特征，在保育猪和育肥猪中检出率较低[19-20]。本研究中，PEDV引起猪群腹泻病以单独感染为主，其在腹泻病样品中检出率较之2010—2013年均显著降低，但在育肥猪腹泻病料中有较高的检出率。母源抗体是保护猪群尤其仔猪抵抗PEDV感染的重要途径，然而其抗体水平往往受病毒感染滴度影响[21-22]。本研究中，河北地区育肥猪的高感染率提示成年猪分泌抗体水平较之2010—2013年可能显著提高，进而增强对猪群免疫保护能力，降低河北省猪群整体PEDV感染率。

PEDV S 蛋白是病毒发生环境适应的关键蛋白，其遗传变异通常与病毒毒力相关，在分析流行毒株的流行趋势和遗传变异中具有重要的进化意义[23]。2010年来，全国多地报道PEDV流行毒株S蛋白与经典毒株变异较大，且分别进化形成多种不同分支[24-27]。Y. Y. Gao等通过对S蛋白遗传进化分析发现2010年后华北猪场中流行的PEDV毒株与韩国来源毒株进化关系较近[23]。本研究中，所获得9条PEDV S蛋白氨基酸序列同源性为96.4%～100.0%。遗传进化分析表明，河北省PEDV S蛋白分处于G2亚群中的2个不同进化分支，均与疫苗株CV777遗传关系较远。其中HB1601和HB1603株与美国分离株亲缘性较近，HB16123、HB16134和HB16135与国内其他地区分离株亲缘性较近，HB1604、HB1605株和HB1619、HB1622株分处的G2a分支则与当前国内外流行毒株遗传关系较远，表明，河北地区流行的PEDV优势毒株可能发生了改变，多种毒株并存。

PEDV S蛋白是Ⅰ型糖蛋白，有27～30个潜在的糖基化位点，这些糖基化位点往往与病毒毒力相关[13, 27]。其在S1区N端包含1个信号肽(l～18 aa)，在S1和S2膜外域编码4个抗原表位(499—638、748—755、764—771和1 368—1 374 aa)，其中499—638 aa为诱导中和抗体产生的核心区域，亦称为COE抗原区域[28-29]。T. Sato等将PEDV在细胞上连续传代致弱，发现S蛋白信号肽、S1和S2膜外区的氨基酸突变是造成毒株毒力减弱的关键因素[30]。本研究对9株PEDV S蛋白氨基酸序列分析，结果显示与国内流行毒株AH2012相比，9株S蛋白氨基酸序列均发生多处突变，部分突变位点与CV777疫苗株相同。同时，与33株参考序列相比，9株S蛋白氨基酸序列在S蛋白膜外区均发生多处独特性突变，表明PEDV S蛋白在河北地区的进化方向具有多样性，其是否影响S蛋白毒力和抗原性尚不得而知。其中，HB1601和HB1603在382—383 aa缺失两位氨基酸(TY)，HB1619和HB1622在234—236 aa插入三位氨基酸突变位点(SAW)，这一插入缺失特征目前尚未有报道。通过生物信息学软件分析发现，在HB1601、HB16123、HB16134、HB16135、HB1604和HB1605株中一些位点突变的发生可能会引起S蛋白糖基化位点失活或引入，推测这些位点突变有可能导致S蛋白毒力改变。此外，与33株参考序列相比，G2a分支和G2b分支S蛋白在COE区分别发生两处和三处独特性突变，这些突变可能会影响COE诱导中和抗体能力，改变毒株抗原性。综上，河北地区PEDVS基因进化分支较多，S蛋白的多种独特突变可能导致PEDV流行毒株毒力和抗原性改变，这一推测有待进一步研究证实。

4　结　论

2016年河北地区腹泻发生率较以往有所下降，PEDV对仔猪的感染情况有所缓解，而对育肥猪感染率较高。PEDVS基因氨基酸序列分析表明，河北省PEDV流行毒株分布在G2群中的2个进化分支，部分毒株发生独特氨基酸突变。

参考文献(References)：

[1]杨汉春. 2010年猪病流行情况与2011年流行趋势及防控对策[J]. 猪业科学, 2011, 28(1): 47-48.

YANG H C. The pig disease epidemic in 2010 and epidemic trend and prevention and control countermeasures in 2011[J].SwineIndustryScience, 2011, 28(1): 47-48. (in Chinese)

[2]ZHANG B, TANG C, YUE H, et al. Viral metagenomics analysis demonstrates the diversity of viral flora in piglet diarrhoeic faeces in China[J].JGenVirol, 2014, 95(Pt 7): 1603-1611.

[3]SUN R Q, CAI R J, CHEN Y Q, et al. Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets, China[J].EmergInfecDis, 2012, 18(1): 161-163.

[4]王隆柏, 林裕胜, 车勇良, 等. 猪流行性腹泻病毒S、N和ORF3基因的遗传变异分析[J]. 畜牧兽医学报, 2014, 45(11): 1830-1836.

WANG L B, LIN Y S, CHE Y L, et al. Genetic variation analysis ofS,NandORF3 genes of porcine epidemic diarrhea virus[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 2014, 45(11): 1830-1836. (in Chinese)

[5]于清磊. 2006—2015年甘肃省猪流行性腹泻流行病学分析[J]. 中国动物检疫, 2017, 34(4): 10-12.

YU Q L. Epidemiological analysis on Porcine Epidemic Diarrhea (PED) in Gansu province during 2006 to 2015[J].ChinaAnimalHealthInspection, 2017, 34(4): 10-12. (in Chinese)

[6]赵振鹏, 杨振, 林伟东, 等. 江苏省猪流行性腹泻病毒的流行病学调查[J]. 安徽农业科学, 2015, 43(19): 125-127, 130.

ZHAO Z P, YANG Z, LIN W D, et al. Epidemiological investigation of porcine epidemic diarrhea disease in Jiangsu Province[J].JournalofAnhuiAgriculturalSciences, 2015, 43(19): 125-127, 130. (in Chinese)

[7]韩庆安, 张志, 李同山, 等. 2010—2013年河北省猪场腹泻病流行病学调查[J]. 中国动物检疫, 2015, 32(5): 5-8.

HAN Q A, ZHANG Z, LI T S, et al. Epidemiological survey of pig diarrhea in farms in Hebei Province during 2010—2013[J].ChinaAnimalHealthInspection, 2015, 32(5): 5-8. (in Chinese)

[8]薛瑞雪, 田野, 田夫林, 等. 山东省部分地区仔猪病毒性腹泻流行病学调查[J]. 中国预防兽医学报, 2015, 37(4): 254-257.

XUE R X, TIAN Y, TIAN F L, et al. Epidemiological investigation of piglet diarrhea virus disease in Shandong province[J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine, 2015, 37(4): 254-257. (in Chinese)

[9]赵梦姣, 陈书民, 成岩, 等. 山东省部分地区猪流行性腹泻流行病学调查及其M基因遗传变异分析[J]. 中国兽医学报, 2013, 33(10): 1504-1508.

ZHAO M J, CHEN S M, CHENG Y, et al. Epidemiological investigation of porcine epidemic diarrhea disease and phylogenetic analysis of M gene of PEDV in Shandong province[J].ChineseJournalofVeterinaryScience, 2013, 33(10): 1504-1508. (in Chinese)

[10]朱子健, 闫丽辉, 鞠妍, 等. 2015～2016年我国东北地区猪病毒性腹泻流行病学调查[J]. 中国预防兽医学报, 2017, 39(5): 356-360.

ZHU Z J, YAN L H, JU Y, et al. The epidemiological investigation on the viral diarrhea in pigs in the Northeast region of China during 2015-2016[J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine, 2017, 39(5): 356-360. (in Chinese)

[11]王娟萍, 刘文俊, 米瑞娟, 等. 山西省猪流行性腹泻流行病学调查[J]. 畜牧与兽医, 2016, 48(9): 116-118.

WANG J P, LIU W J, MI R J, et al. Epidemiological investigation of porcine epidemic diarrhea in Shanxi Province.[J].AnimalHusbandry&VeterinaryMedicine, 2016, 48(9): 116-118. (in Chinese)

[12]LAWRENCE P K, BUMGARDNER E, BEY R F, et al. Genome sequences of porcine epidemic diarrhea virus:invivoandinvitrophenotypes[J].GenomeAnnounc, 2014, 2(3): e00503-14.

[13]DUARTE M, LAUDE H. Sequence of the spike protein of the porcine epidemic diarrhoea virus[J].JGenVirol, 1994, 75(Pt 5): 1195-1200.

[14]王子龙, 韩庆安, 王玉清, 等. 河北省猪病毒性腹泻流行病学调查[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2014(5): 59-60.

WANG Z L, HAN Q A, WANG Y Q, et al. Porcine viral diarrhea epidemiological investigation in Hebei province.[J].HeilongjiangAnimalScienceandVeterinaryMedicine, 2014(5): 59-60. (in Chinese)

[15]阳酉萍, 黄小波, 曹三杰, 等. 四川部分地区猪流行性腹泻的分子流行病学调查[J]. 中国兽医学报, 2015, 35(5): 704-710.

YANG Y P, HUANG X B, CAO S J, et al. Molecular epidemiological investigation porcine epidemic diarrhea in some areas of Sichuan[J].ChineseJournalofVeterinaryScience, 2015, 35(5): 704-710. (in Chinese)

[16]李智丽, 黄淑坚, 马静云, 等. 2011—2015年我国南方地区PEDV分子流行病学调查及S基因遗传变异分析[J]. 广东农业科学, 2016, 43(11): 127-135.

LI Z L, HUANG S J, MA J Y, et al. Molecular epidemiological investigation of PEDV and analysis of genetic variation ofSgene in South China during 2011-2015[J].GuangdongAgriculturalSciences, 2016, 43(11): 127-135. (in Chinese)

[17]胡兴义, 张双翔, 金志强, 等. 贵州地区仔猪病毒性腹泻流行病学调查[J]. 中国预防兽医学报, 2016, 38(7): 542-545.

HU X Y, ZHANG S X, JIN Z Q, et al. The epidemiological investigation on viral diarrhea of piglets in Guizhou region[J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine, 2016, 38(7): 542-545. (in Chinese)

[18]白小磊, 崔进, 崔甜甜, 等. 广东部分地区猪流行性腹泻病毒流行病学调查[J]. 中国兽医学报, 2016, 36(11): 1823-1828, 1863.

BAI X L, CUI J, CUI T T, et al. Molecular characterization and epidemiological survey of porcine epidemic diarrhea virus in some areas of Guangdong[J].ChineseJournalofVeterinaryScience, 2016, 36(11): 1823-1828, 1863. (in Chinese)

[19]林耀民, 宋万杰, 秦云, 等. 猪流行性腹泻的流行现状及防控策略[J]. 中国动物检疫, 2016, 33(5): 62-64.

LIN Y M, SONG W J, QIN Y, et al. The prevalence and prevention strategies of PEDV[J].ChinaAnimalHealthInspection, 2016, 33(5): 62-64. (in Chinese)

[20]刘孝珍, 陈建飞, 时洪艳, 等. 2011年猪流行性腹泻病毒的遗传变异分析[J]. 中国预防兽医学报, 2012, 34(3): 180-183.

LIU X Z, CHEN J F, SHI H Y, et al. Genetic variation analysis of porcine epidemic diarrhea virus isolated in 2011[J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine, 2012, 34(3): 180-183. (in Chinese)

[21]PENSAERT M B, MARTELLI P. Porcine epidemic diarrhea: a retrospect from Europe and matters of debate[J].VirusRes, 2016, 226: 1-6.

[22]POONSUK K, GIMÉNEZ-LIROLA L G, ZHANG J Q, et al. Does circulating antibody play a role in the protection of piglets against porcine epidemic diarrhea virus?[J].PLoSOne, 2016, 11(4): e0153041.

[23]GAO Y Y, KOU Q W, GE X N, et al. Phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus field strains prevailing recently in China[J].ArchVirol, 2013, 158(3): 711-715.

[24]CHEN F Z, KU X G, LI Z H, et al. Genetic characteristics of porcine epidemic diarrhea virus in Chinese mainland, revealing genetic markers of classical and variant virulent parental/attenuated strains[J].Gene, 2016, 588(1): 95-102.

[25]SU Y F, LIU Y C, CHEN Y M, et al. Detection and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus in central China based on the ORF3 gene and the S1 gene[J].VirolJ, 2016, 13: 192.

[26]WANG E Y, GUO D H, LI C Q, et al. Molecular characterization of theORF3 andS1 genes of porcine epidemic diarrhea virus Non S-INDEL strains in seven regions of China, 2015[J].PLoSOne, 2016, 11(8): e0160561.

[27]FAN B C, JIAO D, ZHAO X N, et al. Characterization of Chinese porcine epidemic diarrhea virus with novel insertions and deletions in genome[J].SciRep, 2017, 7: 44209.

[28]PARK S J, MOON H J, YANG J S, et al. Sequence analysis of the partial spike glycoprotein gene of porcine epidemic diarrhea viruses isolated in Korea[J].VirusGenes, 2007, 35(2): 321-332.

[29]CHANG S H, BAE J L, KANG T J, et al. Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus[J].MolCells, 2002, 14(2): 295-299.

[30]SATO T, TAKEYAMA N, KATSUMATA A, et al. Mutations in the spike gene of porcine epidemic diarrhea virus associated with growth adaptationinvitroand attenuation of virulenceinvivo[J].VirusGenes, 2011, 43(1): 72-78.