6种酵母发酵菠萝酒香气成分的GC-MS分析及其筛选

庞惟俏，曲鹏宇，魏程程，郭德军

(1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319； 2.钦州学院食品工程学院，广西钦州 535000)

菠萝（Ananas comosus（Linn.）Merr.），又名凤梨，含有丰富的糖类、蛋白质和维生素等，同时菠萝还具有清热解暑、生津止渴，改善消化不良、小便不利等药用价值[2]。由于菠萝香气浓郁、出汁量高，在微生物的作用下适合进行发酵酿酒，不但可使菠萝的营养成分充分溶出，也可发挥其药用功效[3]。目前，我国菠萝种植面积较大，收获期价格低廉，但市售的菠萝饮品的种类相对较少，如菠萝果汁、菠萝啤酒，而菠萝发酵酒却很少见。因此，开发香气浓郁的菠萝酒是十分有必要的。

在果酒的酿造中，发酵菌种直接影响菠萝酒的品质、酒精度、香气和发酵速度[4]。根据已报道文献，对筛选菠萝酒酿酒酵母的研究相对较少，都集中研究其发酵工艺和其挥发性成分。陈文学等[5]优化菠萝酒的发酵工艺，当工艺参数为添加糖219.8 g/L，调pH3.5，发酵温度为19.8℃时，菠萝酒的口感最佳。孔慧娟等[6]采用GC-MS对菠萝键合态香气成分进行分析和鉴定，确定醇和酚对其香气成分贡献较大。因此，本实验以菠萝为原料，使用6种不同的工业化酿酒酵母菌株进行发酵酿制菠萝酒，并采用顶空固相微萃取法和气相色谱-质谱联用技术，对其挥发性香气成分进行定性定量分析，明确其发酵香气；通过测定其酒精度、总酸等理化指标，并结合感官评价结果，筛选酿造菠萝酒的最佳酿酒酵母，为更好地酿造色泽鲜亮，果香味浓郁，口味协调，酒体稳定的菠萝酒提供参考依据。

1　材料与方法

1.1　材料、试剂及仪器

菠萝，购自大庆九区批发市场；果酒干酵母RC212、AC、71B、2323、EVYRED、K1、酒明串珠菌，购自烟台帝伯仕自酿机械有限公司。

试剂：果胶酶、对甲氧基苯甲醛、亚硫酸（分析纯），上海生工生物工程股份公司。

仪器设备：7890A气相色谱仪、5975质谱仪，Agilent公司；色谱柱：DB-5(60m×0.25mm×0.25μm)，固相微萃取装置，PDMS/DVB 50/30µm萃取头，J&W Sci.公司。DK-8D电热恒温水槽，上海森信实验仪器有限公司；722S可见光分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；TD25-WS多管架自加平衡离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.2　实验方法

1.2.1　菠萝酒的制备

菠萝酒酿造工艺见图1，其操作要点如下。

图1　菠萝酒制备工艺流程图

（1）制备菠萝酒：挑选成熟度高的菠萝作为原料，削皮，榨汁。添加质量分数为0.03%的果胶酶，以提高菠萝的出汁率，50℃恒温水浴2 h。添加蔗糖，其中菠萝汁发酵的总糖度应控制在24%～25%，分3次加入；添加0.03%的硫酸铵，以补充氮源；添加200 mg/L亚硫酸，抑制杂菌繁殖和护色[7-8]。

（2）活化酵母：分别取6种干酵母1 g，35℃条件下置于20 mL质量分数2%蔗糖溶液中并搅拌15 min，30℃恒温静置1.5 h活化后即可使用[9]。

（3）主发酵：将活化后的酵母菌液按质量分数5%接种于菠萝果汁中，25℃恒温发酵14 d。

（4）降酸：由于菠萝酸度过高，使得菠萝酒口感酸涩，因此添加酒明串珠菌(1 g/200 L)促进苹果酸乳酸发酵，20℃恒温发酵28 d，以降低其酸度。

1.2.2　菠萝果汁及酒挥发性成分分析

取约10 mL样品加入40 mL样品瓶中，加入浓度为1.121 μg/mL对甲氧基苯甲醛内标溶液0.1 μL，将样品瓶放入60℃的水浴中平衡10 min，将老化好的萃取针头插入样品瓶中，将石英纤维头暴露于样品瓶的顶空气体中，恒温60℃萃取40 min，用手柄将纤维头推回针头内拔出，插入GC-MS的进样器于250℃条件下解析1 min，同时启动仪器采集数据。

（1）色谱条件。参照杨华等[10]的研究，将色谱条件设为进样口温度250℃，载气He，流速1.0 mL/min。采用程序升温方式，由室温升至80℃保持5 min，然后以4℃/min升至240℃,在此温度下保持2 min，选择不分流进样。

（2）质谱条件。MS离子源在225℃全扫描，电离方式：EI，电子能量70 eV；扫描质量范围：50～500 amu。

1.2.3　定性定量分析菠萝酒

（1）定性分析。利用计算机对采集到的质谱图进行检索，辅助人工解析图谱，与NIST 02.L标准谱库进行对照匹配。

（2）定量分析。根据对甲氧基苯甲醛内标物的浓度，按下面公式计算出菠萝酒中每种挥发性组分的含量。

式中：X—菠萝酒中挥发性成分的浓度，ng/mL；

A0—内标物对甲氧基苯甲醛的峰面积；

Ai—挥发性成分的峰面积；

m—内标物对甲氧基苯甲醛的质量，μg；

V—处理前样品的体积，mL。

1.2.4　菠萝酒感官评定

参照《葡萄酒工业手册》及GB/T 15038—2006，选取10名实验室有经验的品评成员（男女各5人）对菠萝酒进行感官评定，从色泽、香气、口味、风格4个方面进行评分。具体感官评分指标见表1[5，7]。

2　结果与分析

2.1　主要香气成分分析

对菠萝酒的挥发性成分的研究有助于解释其酒体香气及味道。不同酵母发酵的菠萝果汁及酒的主要香气成分分析结果见表2。由表2可知，采用HS-SPME和GC-MS技术，在6种不同酵母发酵的菠萝酒中共检出60种挥发性成分，主要包括酯类27种、醇类8种、酸类6种、酚类5种、烷烃类2种、酮和醛类5种、其他类7种。而在菠萝果汁中仅鉴定出8种香气成分，与菠萝酒相比较，未检出醇类、酚类和烷烃类；菠萝果汁的挥发性成分相对单一，仅有少数的3种酯、1种酸、3种酮醛、1种其他化合物。

表1　菠萝酒感官评定标准

表2　不同酵母发酵的菠萝果汁及酒的主要香气成分

续表2　不同酵母发酵的菠萝果汁及酒的主要香气成分

菠萝果汁经酵母发酵，其挥发性成分的种类和含量明显增多。在71B酵母酿造的菠萝酒中，共检测出21种香气成分，挥发性成分总含量为769.73 ng/mL，其主要挥发性成分为乙酸乙酯（45.48 ng/mL）、3,3-二甲基-1,2-环氧丁烷（515.01ng/mL）、苯乙醇（43.17ng/mL）、辛酸（45.48 ng/mL）。在2323酵母酿造的菠萝酒中，挥发性成分比71B多4种，挥发性成分总含量为473.87 ng/mL，主要香气成分为3,3-二甲基-1,2-环氧丁烷（138.367 ng/mL）、苯乙醇（66.90 ng/mL）、辛酸（41.91ng/mL）、甲苯-2,4-二异氰酸酯（120.55ng/mL）、酞酸二乙酯（25.06 ng/mL）。在AC酵母酿造的菠萝酒中挥发性成分最多，为29种，总含量为561.86 ng/mL。包括甲酸异戊酯（74.64ng/mL）、苯乙醇（68.63ng/mL）、3,3-二甲基-1,2-环氧丁烷（209.95 ng/mL）、4-羟基-2-丁酮（30.49 ng/mL）等主要成分。28种挥发性成分在EVYRED酵母酿造的菠萝酒中被检出，总含量为502.00 ng/mL，主要香气成分为1-戊醇（26.71 ng/mL）、异戊醇（24.15 ng/mL）、苯乙醇（82.04 ng/mL）、辛酸（24.01 ng/mL）、3,3-二甲基-1,2-环氧丁烷（219.91 ng/mL）。K1酵母酿造的菠萝酒的总挥发性成分含量为571.39 ng/mL，包含24种挥发性成分，主要香气成分为乙酸乙酯（26.73 ng/mL）、异戊醇（82.22 ng/mL）、苯乙醇（79.28 ng/mL）、辛酸（22.16 ng/mL）、3,3-二甲基-1,2-环氧丁烷（266.53ng/mL）。RC212酵母酿造的菠萝酒中被检出的挥发性成分种类最少，仅有16种，总含量为763.41ng/mL，主要香气成分为乙酸乙酯（44.70ng/mL）、苯乙醇（84.25 ng/mL）、己酸（20.55 ng/mL）、辛酸（36.84 ng/mL）、3,3-二甲基-1,2-环氧丁烷（510.08ng/mL）。

2.2　不同酵母发酵的菠萝酒挥发性成分的比较分析

2.2.1　酯类成分的比较分析

酯类物质是发酵酒挥发性成分的重要组成部分，也是构成其香气骨架的重要成分。分别经6种酵母发酵的菠萝酒中，酯类化合物的种类和含量较菠萝原液均明显增加，赋予其明显的发酵香气；酵母菌2323菌株发酵的菠萝酒中酯含量最高，为176.32 ng/mL，是原液含量的10倍；EVYRED菌株发酵的酯含量最低，为76.51 ng/mL，这表明不同酵母菌株发酵所能产生的酯类含量差异性较大。乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇乙酸酯、甲苯-2,4-二异氰酸酯、十四酸乙酯是6种菠萝酒的共有酯类物质，且经酵母发酵后含量大量增加，这是因为酵母能促进酯化反应的产生[11]。酞酸二乙酯仅在2323菌株的发酵酒中被检出，含量为25.06 ng/mL，具有芳香气味，目前，未见在菠萝酒中检出的报道。经6种酵母发酵后的菠萝酒中增加的酯类还包括乙酸乙酯、乙酸苯乙酯等，这些化合物可增加酒体的整体香气并丰富香气的复杂性，具有辅助增香作用[12]。

2.2.2　醇类成分的比较分析

酵母代谢菠萝原液中的糖类物质，转化成醇类化合物[13]。除乙醇外，菠萝汁分别经6种酵母发酵后产生的醇类主要包括1-戊醇、异戊醇、苯乙醇，每种醇的含量均大于10 ng/mL。6种菠萝酒中共有的醇类成分只有苯乙醇，同时含量也较高，苯乙醇具有清甜的玫瑰花香和水果香气[14]，符合中国人的口味偏好；酵母RC212酿造的菠萝酒中苯乙醇含量最高，为84.25 ng/mL。孔慧娟[6]在菠萝酒中检出50 ng/mL的苯乙醇，并证实其给人柔和的愉悦感。K1酵母发酵的菠萝酒中异戊醇含量较高，为82.22 ng/mL，但异戊醇有令人不悦的苦杏仁味道，影响其口感[15]，除EVYRED和K1菌株以外的其他酵母酿造的菠萝酒中未检出该物质。

2.2.3　酸类、酚类成分的比较分析

有机酸是保持果酒中酒体平衡和口感清爽特性的主要物质[16]。菠萝酒中的酸类物质使得其略带酸味，主要是糖的丁酸发酵和蛋白质氧化时的产物。6种菠萝酒中共有的酸类香气成分有辛酸和己酸，且含量也较多；它增加了菠萝酒的柔和口感，但原液中未检出，这两种酸应该是酿酒酵母的代谢产物；其中，71B酵母酿制的菠萝酒中辛酸含量最高，为45.48 ng/mL。在菠萝果汁中检出3.31 ng/mL肉桂酸，但在所有菠萝酒中未检出肉桂酸，这可能是因为酒明串珠菌将该酸转化为醇，使得含量减少[17]。4.76 ng/mL的棕榈酸在酵母EVYRED菌株发酵的菠萝酒中检出，张庆庆[13]在红曲菠萝酒中也检出少量棕榈酸；导致其含量较低的原因可能是其与醇发生酯化反应生成棕榈酸乙酯。菠萝果汁中未检出酚类物质，但4-乙烯基-2-甲氧基苯酚在所有果酒中被检出，呈强烈丁香和发酵似香气，有炒花生气息。71B酵母发酵的酒中该化合物的含量较多，为17.94 ng/mL，该酚是酵母菌代谢产生的次级产物。6种果酒中其他酚类化合物含量相对较少，但其与醇、酸和酯共同组成菠萝酒圆润的香气。2.2.4醛酮类成分的比较分析

6种菠萝酒中的醛酮类香气成分的种类和含量较少，在菠萝果汁及果酒中未发现共同的羰基化合物。AC酿造的菠萝酒中，4-羟基-2-丁酮含量最高，为30.49 ng/mL，其可赋予菠萝酒芳香气味。1.79 ng/mL的2-羟基-4-甲基苯甲醛和11.18 ng/mL的3-辛酮仅在菠萝汁中被检出，这可能是因为该化合物被酵母利用转化成醇类化合物。对比已发表文献，在菠萝酒中检出的醛酮化合物含量均不高，但其与其他种类的化合物相互作用，有助于菠萝酒的增香[18]。

2.2.5　其他类成分的比较分析

其他类化合物尽管种类和含量较少，但对菠萝酒的香气构成也有贡献作用。菠萝酒中检测到的其他类挥发性成分共7种，主要存在于71B、2323、AC、EVYRED酵母菌株酿造的菠萝酒当中，含量最多的为酵母AC酿造的菠萝酒，为17.65 ng/mL。3,4-环氧四氢呋喃只在菠萝汁中被发现，符桢华[19]在菠萝发酵的果醋中也检出该呋喃化合物，并证实其是菠萝醋的典型风味成分。

表3　不同酵母发酵的菠萝酒的感官评价结果及理化指标

2.3　菠萝酒的理化性质和感官评定结果

通过对不同菌株发酵的菠萝酒的理化指标和感官评价进行测定，结果见表3。感官评分排名为2323＞EVYRED＞71B＞RC212＞AC＞K1。2323和EVYRED酵母的产酒能力强，残糖低，酸度较低，感官评价综合评分比较高，且风格和口味较佳，适合用于酿造菠萝酒；71B酵母产酒能力强，酸度较低，但是风味、口感皆不佳，感官评定总分低；RC212、K1、AC酵母酿制的菠萝酒香气较佳，但酒口感酸，综合评分较低，不太受品鉴者欢迎。

不同酵母菌株发酵对菠萝酒风味的影响较大，其主要的影响来源于挥发性成分的差异。贾言言也报道梅奇酵母属的M.agaves可用于菠萝酒的酿造，并可获得丰满的酒体[11]。

3　结论

GC-MS分析表明，菠萝汁经发酵后，其挥发性化合物的种类和含量明显增加，这与酵母的酶活和代谢中间产物种类关系较大。在菠萝发酵酒中检出60种挥发性成分，而在菠萝汁中共有8种挥发性成分被检出，增加了52种挥发性成分，其中两者共有的主要成分有8种。不同酵母发酵的菠萝酒香气具有明显的差异性，主要的挥发性香气成分是酯类、醇类、酸类、酚类和醛酮类仅占少部分，这预示着酵母菌株是影响菠萝酒发酵品质的一个重要因素。同时，GC-MS分析结果也佐证了理化指标和感官评定结果，酒的酯香可能是中国人偏爱的一个重要的香气取向；侧重感官评定，故选取2323酵母菌株为酿造菠萝酒的最优菌种。由于菠萝果汁及菠萝酒中的各种挥发性香气成分的含量、种类、感官阈值以及相互作用决定其最终的香气特征，所以菠萝果酒中的某些特征组分的相互作用和发酵控制还需进一步地探索与验证。

参考文献：

[1]PANJAI L,ONGTHIP K,CHOMSRI N.Complex fruit wine produced from dual culture fermentation of pineapple juice with Torulaspora delbrueckii andSaccharomyces cerevisiae[J].Asian journal of food and agro-industry,2009,2(2)：135-139.

[2]JOLLY N P,VARELA C,PRETORIUS I S.Not your ordinary yeast:non-Saccharomycesyeasts in wine production uncovered[J].FEMS yeast research,2014,14(2)：215-237.

[3]张亚军.菠萝酒酿造法[J].农村新技术,2009(6)：61-62.

[4]SUN S Y,GONG H S,JIANG X M,et al.Selected non-Saccharomyceswine yeasts in controlled multistarter fermentations withSaccharomyces cerevisiaeon alcoholic fermentation behaviour and wine aroma of cherry wines[J].Food microbiology,2014,44(5)：15-23.

[5]陈文学,胡月英,林俊芳,等.菠萝酒酿造工艺研究[J].食品科学,2010,31(19)：259-262.

[6]孔慧娟,赵国玲,汪雯岚,等.6种水果中键合态香气成分的气相色谱-质谱法鉴定与比较[J].食品科学,2015,36(14)：140-144.

[7]李涛,仲惟.菠萝果酒的发酵工艺研究[J].现代食品科技,2011,27(9)：1123-1126.

[8]胡月英,仇厚援,陈文学,等.菠萝酒酿造工艺研究[J].中国酿造,2010(6)：172-174.

[9]刘亚娜.红树莓酒酿造工艺及其抗氧化活性的研究[D].大庆：黑龙江八一农垦大学,2016.

[10]杨华,刘亚娜,郭德军.红豆越橘果汁及发酵果酒香气成分的GC-MS分析[J].中国酿造,2014,33(12)：133-138.

[11]贾言言.2株非酵母属酵母对酿造菠萝酒和番木瓜酒风味的影响[D].海口：海南大学,2015.

[12]李艳,张俊娜,李志西,等.利用菠萝酒合成细菌纤维素的发酵培养基优化[J].西北农业学报,2013,22(7)：84-89.

[13]张庆庆,郑天柱,汤文晶,等.红曲菠萝酒发酵及香气成分的分析[J].食品工业科技,2015,36(19)：299-317.

[14]贾言言,刘四新,李卓婷,等.非酵母属酵母的接种顺序对混合发酵菠萝酒香气成分的影响[J].食品科学,2015,36(17)：152-157.

[15]李涛,仲惟.菠萝酒的发酵工艺研究[J].现代食品科技,2011,27(9)：1123-1126.

[16]朱龙宝,杨幼慧,周冠华.发酵前澄清处理对菠萝酒品质的影响[J].食品与发酵工业,2006,(8)：125-127.

[17]张爱红,王玲,徐小然.菠萝酒发酵菌种的筛选研究[J].酿酒,2005(2)：66-67.

[18]叶日英.固定化酵母低温发酵菠萝酒研究[J].食品科技,2000(2)：46-47.

[19]符桢华,陈华勇,王永华.菠萝果醋风味成分的GC-MS分析[J].中国酿造,2009(12)：118-121.

[20]吴惠婵,王秀杏,宁正祥,等.发酵菠萝酒的风味及其稳定性研究[J].现代食品科技,2012,28(2)：191-194.

[21]钟姝霞,李觅,邓杰,等.半干型菠萝果酒发酵工艺条件优化[J].中国酿造,2015(11)：162-166.