微量元素配施对甜菊生长和甜菊糖苷含量的影响

杨永恒，徐晓洋，孙玉明，张永侠，包亚英，原海燕，黄苏珍，佟海英

（江苏省中国科学院植物研究所，江苏 南京 210014）

甜菊（Stevia rebaudiana Bertoni）又称甜叶菊，是原产南美洲的菊科多年生草本植物。因其植物体（主要是叶片）所含甜菊糖苷（Steviol glycosides）具有高甜度（甜度约为蔗糖的250～450倍）、低热量（化学结构稳定几乎不参与机体代谢，热量仅为蔗糖的1/300）等特性[1]，以及预防和辅助治疗肥胖症[2]、糖尿病[3]、高血压[4]、高血糖[5]，以及消炎、抗氧化、抗菌、抗癌、增强免疫力[6-7]等药用价值而备受关注，近年来已被作为天然零卡路里甜味剂广泛应用于食品、饮料、医药、保健等领域。

锌、硼、锰、钼是常见的微量元素肥料，在植物生长发育过程中起重要作用。锌参与叶绿素的合成，促进光合作用，能改善植物品质；硼能促进根系吸收养分，促进开花结实；锰是许多酶的活化剂，直接参与光合作用，影响氮、磷代谢；钼参与碳、氮素代谢，缺钼使植株光合能力下降[8]。王晓菁等[9]对枸杞（Lycium barbarum）进行叶面喷施硫酸锌试验研究发现，随锌肥喷施浓度的增加，枸杞有效成分及微量元素含量均显著提高，锌肥过量时则呈下降趋势，认为最适浓度为Zn 0.05%。胡华锋等[10]研究发现适当配施微肥能显著提高紫花苜蓿产草量和粗蛋白、粗脂肪、磷、钙的含量，降低粗灰分、粗纤维、无氮浸出物的含量。孟杰等[11]研究不同浓度Zn、B、Mo配施对北柴胡（Bupleurum chinense）产量及柴胡皂苷a、d含量的影响发现，适宜配比的Zn、B、Mo配施对北柴胡干物质积累及柴胡皂苷a、d总量有积极的调节作用，施Zn 48.45 g/hm2、B 355.05 g/hm2、Mo 86.40 g/hm2时产量最大，施Zn 36.15 g/hm2、B 343.05 g/hm2、Mo 106.35 g/hm2时品质最佳。曾小燕[12]研究发现在甜菊分枝初期喷施高锰酸钾（3 mg/g）或钼酸铵（3 mg/g）或硼酸（0.5 mg/g）均可显著增加R-A、总苷和游离氨基酸含量，在分枝盛期喷施3 mg/g氯化锌可显著增加R-A、游离氨基酸和粗纤维含量。尽管众多研究表明微量元素有助于植物有效成分的积累，然而目前在甜菊栽培营养研究方面缺乏对微量元素对甜菊生长及甜菊糖苷含量影响的系统研究。为此，本文采用盆栽试验方法，研究锌、硼、锰、钼配施对甜菊生长和糖苷含量的影响，以期为生产优质甜菊、提高经济效益提供科学依据和理论基础。

1　材料与方法

1.1　试验材料

供试材料为甜菊品种‘中山4号’（‘Zhongshan No.4’）扦插繁殖的当年生植株，种源来自江苏省中国科学院植物研究所甜菊种质资源圃。

1.2　试验方法

于2015年4月22日至7月21日在普通温室进行盆栽试验。选取株高和茎粗基本一致的甜菊扦插苗栽植于塑料盆（高20.0 cm、口径20.0 cm、底径14.5 cm，底部有小孔）中，盆底有托盘，每盆装3.0 kg栽培基质。栽培基质为园土、草炭、珍珠岩和河沙，混合基质体积比为5∶2∶2∶1；园土取自江苏省中国科学院植物研究所南京中山植物园林下，其基本理化性质为：有机质含量1.99%，全氮、速效磷和速效钾含量（mg/kg）分别为1000.00、1.67和 122.12，全量锌 56.00 mg/kg，全量锰 962.00 mg/kg，全量硼和全量钼未检出，pH 6.0。

1.2.1试验设计大量元素氮、磷、钾肥施入量分别为纯N 600 mg/kg、P2O5300 mg/kg和K2O 600 mg/kg。微量元素 Zn、Mn和 Mo设质量分数 均 为 0% 、0．1% 、0．2% 和 0．3%共4个水平；微量元素B设质量分数为 0%、0．05%、0．1%和 0．2%共4个水平，构成4因素4水平的正交设计表共16个处理 （表1），其中，氮肥为尿素，磷肥为过磷酸钙，钾肥为氯化钾，锌肥为七水合硫酸锌，硼肥为硼酸，锰肥为一水合硫酸锰，钼肥为钼酸铵。移栽时将全部磷肥和50%钾肥作为基肥一次施入，5月12日施入 30%氮肥，6月 12日施入40%氮肥和50%钾肥，7月2日施入30%氮肥；微量元素肥料分别于6月19日和7月15日喷施；每处理设3次重复。实验过程中采取常规水分管理，并及时将托盘内的溢出溶液倒回，以防养分流失。

1.2.2测定指标及方法

1.2.2.1生长指标测定试验结束时，用直尺测定株高，即从地面到植株顶端的高度；用数显游标卡尺测定茎粗，即植株中部（株高1/3～2/3处）的直径；用直尺测定叶长和叶宽，植株中部叶片叶基至叶尖的长度即为叶长，叶片最宽处的长度即为叶宽。分别收集各单株的茎和叶，洗净后于105℃杀青15 min，再于75℃烘干至恒质量。

1.2.2.2光合色素含量测定采用95%乙醇浸提法[13]，取新鲜的甜菊叶片0．1 g剪碎，共取3份，分别置于15 mL带塞试管中，每个试管中加入5 mL 95%乙醇溶液，并使叶片完全浸没在溶液中，加上塞子，置于暗处24 h，待试管中的甜菊叶片颜色变成白色时，进行比色测定。将色素提取液倒入比色杯中，以95%乙醇溶液为对照，在紫外分光光度计上波长665 nm、649 nm、470 nm下测定吸光度。95%乙醇浸提液中色素浓度（mg/L）计算公式：

表1　盆栽试验处理和施肥量Table 1　Treatments and application rates of pot experiment

1.2.2.3糖苷含量测定采用高效液相色谱法[13-14]。仪器为上海伍丰LC100高效液相色谱（包括紫外检测器和色谱工作站）， 色谱柱为 Hypersil-NH2 （250．0 mm×4．6 mm，5 μm）（大连依利特分析仪器有限公司），St和R-A标准品均购自日本和光纯药工业株氏会社，纯度均大于99．0%。

于现蕾期收获各处理甜菊植株叶片烘干，干燥密封保存至使用。取贮存的甜菊干叶，于烘箱中70℃烘至恒重，用研钵磨成粉末，准确称取粉末0．2 g，装入15 mL具塞试管中，加入10 mL 80%乙醇，摇匀，80℃水浴30 min，期间摇匀几次，冷却后于低速离心机中离心10 min，吸取上清1 mL至离心管中，开盖置于烘箱中70℃过夜，使溶剂挥发干净，加1 mL色谱甲醇充分溶解提取物，经0．22 μm滤膜过滤后待测。3次重复。

分别精确称取St（Stevioside）和R-A标准品，用色谱甲醇配成质量浓度为1 mg/mL的标准品溶液，经0．22 μm 滤膜过滤，分别吸取标准品溶液 4、8、12、16、20 μL 依次进样分析，流速 1．2 mL/min，流动相为乙腈∶水=80∶20，测定波长210 nm。以样品浓度为纵坐标y，峰面积为横坐标x绘制标准曲线。

采用与标准品溶液相同的色谱条件对甜菊叶样品中的St、R-A含量进行测定，进样量20 μL，依据各标准品的标准曲线，采用外标法计算干叶样品中St和R-A的含量。

1.3　数据整理和统计分析

采用Excel2010软件对实验数据进行处理，并采用SPSS 19．0统计分析软件对数据进行统计分析；采用Duncan’s新复极差法进行差异显著性检验（P ＜ 0．05）。

2　结果与分析

2.1　锌、硼、锰、钼配施对甜菊生长的影响

由盆栽试验结果（如表2）可见，M2、M4和M9处理甜菊株高显著高于对照，其中，M4处理甜菊株高最大，比对照增加15.8%；其余各处理甜菊株高均与对照无显著差异。除M3和M6处理外，其余各处理甜菊茎粗均显著高于对照，其中，M16处理甜菊茎粗最大，比对照增加39.8%；M7、M8、M9和M11处理间以及M2、M5、M13和M14处理间茎粗均无显著差异。M12和M14处理甜菊叶长均显著高于对照，M12处理甜菊叶长最大，比对照增加16.3%；其余各处理叶长均与对照无显著差异。M3、M7、M12、M14和M16处理甜菊叶宽均显著高于对照，其中，M7处理甜菊叶宽最大，比对照增加32.6%；其余各处理叶宽均与对照无显著差异。

表2　锌、硼、锰、钼配施对甜菊生长的影响Table 2　Effects of combined fertilization of Zn, B, Mn and Mo on stevia growth

分析不同锌、硼、锰、钼水平对甜菊生长的影响（表3），其中甜菊株高R值大小顺序为：Zn>Mo>Mn>B，说明影响甜菊株高的重要性顺序为：Zn>Mo>Mn>B。4种肥料对株高的影响均未达到显著水平。

甜菊茎粗R值大小顺序为：Zn>B>Mo>Mn，说明影响甜菊茎粗的重要性顺序为：Zn>B>Mo>Mn。施Zn对甜菊茎粗有显著影响，Zn3和Zn4处理甜菊茎粗显著大于Zn1处理，分别比Zn1处理增加16.6%和12.5%；B、Mn和Mo对甜菊茎粗均无显著影响，B4处理甜菊茎粗最大，比B1处理增加9.3%；Mn2处理甜菊茎粗最大，比Mn1处理增加5.1%；Mo2处理甜菊茎粗最大，比Mo1处理增加3.8%。甜菊叶长R值大小顺序为：Mo>B>Zn>Mn，说明影响甜菊叶长的重要性顺序为：Mo>B>Zn>Mn；甜菊叶宽R值大小顺序为：B>Mo>Mn>Zn，说明影响甜菊叶宽的重要性顺序为：B>Mo>Mn>Zn。尽管4种肥料处理下甜菊叶长叶宽差异没有达到显著，但施用微肥对甜菊叶长叶宽仍有一定的影响。

2.2　锌、硼、锰、钼配施对甜菊叶片光合色素含量的影响

光合色素含量分析结果表明（表4），M16处理甜菊叶片中叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量均最高，分别比对照显著增加64.9%、44.7%、58.5%和64.8%。M8、M11和M16处理叶绿素a含量显著高于对照，其余各处理叶绿素a含量均与对照无显著差异；M11和M16处理叶绿素b和总叶绿素含量均显著高于对照，其余各处理叶绿素b和总叶绿素含量均与对照无显著差异；M2、M4、M5、M8、M10和M16处理类胡萝卜素含量显著高于对照，其余各处理类胡萝卜素含量均与对照无显著差异。

表3　不同锌、硼、锰、钼水平对甜菊生长的影响Table 3　Effects of Zn, B, Mn and Mo fertilization on stevia growth

表4　锌、硼、锰、钼配施对甜菊叶片中光合色素含量的影响Table 4　Effects of Zn, B, Mn and Mo formula fertilization on photosynthetic pigment contents of stevia leaves

根据不同锌、硼、锰、钼水平对甜菊叶片中光合色素含量的影响分析（表5）可知，甜菊叶片中叶绿素a含量R值大小顺序为：Mo>Zn>B>Mn，说明影响甜菊叶片中叶绿素a含量的重要性顺序为：Mo>Zn>B>Mn。Zn、B和Mn对叶绿素a含量的影响均未达到显著水平；施Mo对叶绿素a含量有显著影响，Mo2和Mo3处理叶绿素a含量显著高于Mo1处理，其中，Mo3处理叶绿素a含量最高，比对照增加25.6%。

甜菊叶片中叶绿素b含量R值大小顺序为：Mo>Mn>Zn>B，说明影响叶绿素b含量的重要性顺序为：Mo>Mn>Zn>B。Zn、B和Mn对叶绿素b含量的影响均未达到显著水平；施Mo对叶绿素b含量影响显著，Mo2和Mo3处理叶绿素b含量显著高于Mo1处理，其中，Mo2处理叶绿素b含量最高，比对照增加22.9%。

甜菊叶片中总叶绿素含量R值大小顺序为：Mo>Zn>Mn>B，说明影响总叶绿素含量的重要性顺序为：Mo>Zn>Mn>B。Zn、B和Mn对总叶绿素含量的影响均未达到显著水平；施Mo对总叶绿素含量影响显著，Mo2和Mo3处理总叶绿素含量均显著高于Mo1处理，其中，Mo3处理总叶绿素含量最高，比对照增加24.4%。

甜菊叶片中类胡萝卜素含量R值大小顺序为：B>Mo>Mn>Zn，说明影响类胡萝卜素含量的重要性顺序为：B>Mo>Mn>Zn。施B对类胡萝卜素含量影响显著，其中，B4处理类胡萝卜素含量最高，比对照增加25.8%。

2.3　锌、硼、锰、钼配施对甜菊叶片中糖苷含量的影响

试验采用HPLC法测定不同锌、硼、锰、钼配施处理下各组甜菊叶片中St和R-A苷含量（表6），结果表明，M9、M13和M15处理的St含量均显著低于对照，其余各处理St含量均与对照无显著差异。M7和M9处理R-A含量显著高于对照，其中，M7处理R-A含量最高，比对照增加42.0%。M3和M7处理总苷含量显著高于对照，其中，M7 处理总苷含量最高，比对照增加 29.3%。 M2、M5、M6、M7、M9、M10、M12 和 M13 处理的St/总苷均显著低于对照，以 M9 处理 St/总苷最低；反之，M2、M5、M6、M7、M9、M10、M12 和 M13 处理的 R-A/总苷均显著高于对照，以M9处理R-A/总苷最高，比对照增加14.6%。

表5　不同锌、硼、锰、钼水平对甜菊叶片光合色素含量的影响Table 5　Effects of Zn, B, Mn and Mo fertilization on photosynthetic pigment contents of stevia leaves

表6　锌、硼、锰、钼肥配施对甜菊叶片中糖苷含量的影响Table 6　Effects of Zn, B, Mn and Mo formula fertilization on steviol glycosides content of stevia leaves

不同锌、硼、锰、钼水平对甜菊叶片中糖苷含量的影响分析如表7，可知甜菊St含量R值大小顺序为：Zn>B=Mo>Mn，说明影响St含量的重要性顺序为：Zn>B=Mo>Mn。B、Mn 和 Mo对 St含量的影响均未达到显著水平；随施Zn量的增加，St含量呈下降趋势，各施锌处理St含量均低于Zn1处理，且Zn4处理显著低于Zn1处理。

甜菊R-A含量R值大小顺序为：Zn>Mn>B>Mo，说明影响R-A含量的重要性顺序为：Zn>Mn>B>Mo。4种肥料对R-A含量的影响均未达到显著水平。

甜菊总苷含量R值大小顺序为：Zn>Mn>B>Mo，说明影响甜菊总苷含量的重要性顺序为：Zn>Mn>B>Mo。 B、Mn和Mo对甜菊总苷含量的影响均未达到显著水平；随施Zn量的增加，甜菊总苷含量呈先升后降趋势，Zn3处理达到最大值，比Zn1处理增加3.3%，Zn4处理总苷含量低于Zn1处理。

甜菊St/总苷与R-A/总苷的R值大小顺序均为：Zn>Mn>Mo>B，说明影响St/总苷、R-A/总苷的重要性顺序为：Zn>Mn>Mo>B。4种肥料对St/总苷、R-A/总苷均未达到显著水平。

表7　不同锌、硼、锰、钼水平对甜菊叶片中糖苷含量的影响Table 7　Effects of Zn, B, Mn and Mo fertilization on steviol glycosides content of stevia leaves

3　讨论

3.1　锌、硼、锰、钼配施对甜菊生长的影响效应

微量元素参与蛋白质、碳水化合物、脂类、核酸等多种代谢活动，是植物体内多种酶及其活化剂的组成成分，其丰缺对植物的生长发育有着不同程度的影响。锌可以活化草酸乙酸氧化酶、烯醇化酶等，在光合、呼吸、氮代谢、激素合成等方面有重要作用；缺锌时核糖核酸含量减少，蛋白质合成受阻。硼对植物各种营养器官的建造是必需的，充足的硼对维持叶片功能起着重要作用；缺硼使叶片表面变形，气孔关闭，叶绿体发育不全，线粒体基质含量减少，疏导组织受阻。锰是维持叶绿体结构的必需元素，是SOD的重要组成元素，对维持叶绿体细胞膜正常结构有重要作用。钼参与碳、氮素代谢，缺钼使植株光合能力下降[15]。王苏影等[16]研究发现叶面喷施锌肥和锰肥均可促进芝麻（Sesamum indicum）生长，使叶绿素含量和产量增加。曹秀霞等[17]研究发现增施硼肥可以提高旱地胡麻（Linum usitatissimum）植株的株高、主茎分枝、有效结果数和每果粒数等农艺性状以及植株鲜重和干重。本研究结果显示，合理配施锌、硼、锰、钼可促进甜菊生长发育，M4处理（Zn 0%、B 0.2%、Mn 0.3%和Mo 0.3%）甜菊株高最大，M16处理（Zn 0.3%、B 0.2%、Mn 0%和Mo 0.2%）甜菊茎粗、叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量均最大，M12处理（Zn 0.2%、B 0.2%、Mn 0.1%和Mo 0%）甜菊叶长最大，M7处理（Zn 0.1%、B 0.1%、Mn 0.3%和Mo 0%）甜菊叶宽最大。施用硼肥和锰肥对甜菊株高、茎粗、叶长、叶宽、各光合色素含量（除类胡萝卜素含量）均无显著影响；施锌显著影响甜菊茎粗，Zn 0.2%和Zn 0.3%处理甜菊茎粗显著大于Zn 0%处理，其余施肥处理对甜菊茎粗无显著影响；施钼显著影响甜菊叶片中叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量，Mo 0.2%处理叶绿素a和总叶绿素含量均最高，Mo 0.1%处理叶绿素b含量最高；其余施肥处理对甜菊各光合色素含量无显著影响。经方差分析检验，钼影响很大，锌、硼和锰对甜菊叶片中叶绿素含量的影响也较大，但均未达到显著水平，推测可能由于各个元素所构成的酶的种类与功能不同，从而影响整个植株代谢过程所导致。

3.2　锌、硼、锰、钼配施对甜菊糖苷含量的影响效应

施用微量元素肥料对改善植物有效部位的品质有重要影响。锌是多种酶的活化剂，与蛋白质合成、成熟叶片矿质元素含量和碳水化合物代谢有关；正常的硼营养能改善植株各器官有机物的供应状况，加速体内糖的合成与运转，缺硼时植株体内糖类物质的合成与运输受到抑制；锰是许多肽酶的活化离子，可促进氨基酸合成肽键，有利于蛋白质的合成[18]。施钼能提高植株中碳水化合物和可溶性糖含量，同时能提高多种氨基酸含量[19]。本研究结果显示，M9、M13和M15处理St含量显著低于对照；M7处理（Zn 0.1%、B 0.1%、Mn 0.3%和Mo 0%）R-A和总苷含量均最高；M9处理（Zn 0.2%、B 0%、Mn 0.2%和Mo 0.3%）St/总苷最低，而R-A/总苷最高。经方差分析检验，锌对各指标影响的重要性最大，施用硼肥、锰肥和钼肥对甜菊St、R-A、总苷含量、St/总苷和R-A/总苷均无显著影响；施用锌肥对甜菊R-A含量、St/总苷和R-A/总苷均无显著影响，但施锌对甜菊St和总苷含量影响显著，随锌肥施用量的增加，甜菊St含量呈下降趋势，总苷含量呈先升后降趋势，Zn 0.2%处理达到最大值。

综上所述，在甜菊生长期间，应合理施肥，在甜菊分枝初期和分枝盛期叶面喷施七水合硫酸锌0.2%～0.3%，硼酸0%～0.1%，一水合硫酸锰0.2%～0.3%，钼酸铵0.2%~0.3%有助于植株生长和糖苷积累。

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