ERCC1的表达与非小细胞肺癌根治术后患者的预后相关性研究

罗洞波， 赵书源， 何 丹

含铂类的两药联合化疗是目前非小细胞肺癌(nonsmall-cell lung cancer, NSCLC)的一线化疗方案[1]。铂类在肿瘤细胞内水解成双氯双氨铂，然后形成DNA-铂类复合物，阻止肿瘤细胞DNA的复制，发挥其细胞毒性作用。肿瘤细胞一旦对顺铂产生耐药，将严重影响NSCLC的治疗效果。目前，已知核苷酸切除修复(nucleotide excision repair, NER)是顺铂耐药的重要机制之一，而切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-complementation group 1, ERCC1)是NER途径的重要因素，在顺铂耐药中起重要作用。

ERCC1位于人类染色体19q13.2，是一种单链DNA核酸内切酶，是NER途径的限速酶，而NER途径在机体DNA损伤修复过程中发挥着重要作用。ERCC1的表达在一定水平上反映DNA的修复能力(DNA repair capability, DRC)。机体DRC降低，使得细胞DNA损伤不能及时得到修复，从而增强肺癌易感性。相反，ERCC1过表达可导致DNA-铂类复合物的修复，产生铂类耐药。目前，关于ERCC1的临床研究多为回顾性研究，主要针对晚期的NSCLC患者，研究结果表明，ERCC1的表达可以作为顺铂敏感性的预测指标[2-4]。一项关于ERCC1 mRNA的NSCLC的临床试验表明，肿瘤组织中ERCC1 mRNA水平与顺铂的两药联合方案反应率密切相关[5]。Meta分析表明，ERCC1是晚期NSCLC患者对铂类的反应率和总生存期的重要指标[6]。因此,有必要在NSCLC术后人群中对这一指标进行预后验证性分析。

1 对象与方法

1.1对象 收集2010年1月1日-2014年12月31日接受标准肺癌根治术(肺叶切除+系统性纵膈淋巴结清扫)的NSCLC患者137例，男性86例，女性51例；年龄(64±18)岁。Ⅰ期49例，Ⅱ期34例，Ⅲ期54例(UICC2007版)；鳞癌57例，腺癌80例。患者的一般情况见表1。

入选标准：(1)术后进行规律随访；(2)未接受过术前放化疗；(3)Ⅰ期患者术后未行术后辅助化疗，Ⅱ及Ⅲ期患者术后接受过系统性含铂方案两药联合化疗4周期；(4)有癌组织和癌旁组织病理标本。

1.2随访情况 采取电话随访，随访时间自手术之日起，截止至2016年1月1日，随访率95%。终点事件为肿瘤复发或患者死亡。评价指标为患者1，2及3年的无病生存(disease-free survival，DFS)率和总生存(overall survival，OS)率。

表1 非小细胞肺癌患者的临床资料和ERCC1的表达情况

☆：每天吸烟支数×吸烟年数. ERCC1:切除修复交叉互补基因1.

1.3免疫组织化学方法 参照文献[6]，采用免疫组织化学法检测ERCC1。取NSCLC组织与肺组织蜡块，切片厚5 μm，经常规脱蜡水化后，以3%的H2O2温育20 min灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3次，每次5 min；高温抗原修复10 min，0.1 mol/L PBS洗涤3次，每次5 min；滴加正常血清封闭液，室温温育30 min，除去多余液体；滴加1∶80鼠抗人ERCC1单抗(1∶100倍稀释)，37 ℃ 1 h，4 ℃冰箱放置过夜；0.1 mol/L PBS洗涤3次，每次5 min；滴加生物素化二抗，37 ℃ 60 min。0.1 mol/L PBS洗涤3次，每次5 min；滴加试剂SABC，37 ℃ 60 min，0.1 mol/L PBS洗涤3次，每次5 min；DAB显色5 min；苏木精复染，脱水。二甲苯透明，中性树脂封片。由2位病理科高级职称医师随机独立阅片后，取平均分。评分标准参照文献[7]介绍的方法，即每张切片随机观察5个高倍(×400)视野，并计数100个肿瘤细胞。采用细胞显色强度评分与阳性肿瘤细胞百分比的乘积求得半定量H-score评分，作为蛋白表达的相对强度。具体评分方法为：(1)按显色程度分4级：阴性(不着色)、弱阳性(淡黄色)、阳性(棕黄色)、强阳性(棕褐色)，分别计0，1，2，3分；(2)阳性肿瘤细胞百分比：无(0)、1%～9%(0.1)、10%～50%(0.5)、>50%(1.0)。ERCC1在鳞癌和腺癌组织强阳性结果(即H-score=3)，染色定位于细胞核内(图1A，1B);ERCC1在鳞癌和腺癌阴性染色结果(即H-score=0)(图1C，1D)。癌组织中位评分为2，癌旁组织中位评分为0.5。因此将癌组织中H-score评分≥2认定为阳性(即肿瘤细胞染色强度>2，且染色百分比>50%)；反之为阴性。

ERCC1在细胞中定位于细胞核内，A和B即鳞癌和腺癌组织中强阳性结果(H-score=3)，C和D为鳞癌和腺癌中阴性结果(H-score=0).图1 ERCC1在癌组织和癌旁组织的表达Fig 1 ERCC1 expression in the NSCLC tumor and adjacent tissues

1.4统计学处理 采用SPSS 20.0软件进行统计分析，一般临床资料比较采用χ2检验和非参数Wilcoxon秩和检验；生存分析采用Kaplan-Meier法中Breslow检验。多因素分析采用Cox回归模型。P<0.05为差别具有统计学意义。

2 结 果

2.1ERCC1在NSCLC患者癌组织和癌旁组织中的表达 137例NSCLC患者ERCC1癌旁组织或癌组织的H-score评分如下：0～0.5分为120和26例；1～1.5分为16和34例，2～3分为1和77例(图2A)。癌组织的中位评分为2分，高于癌旁组织的中位评分0.5分，非参数Wilcoxon秩和检验结果显示，二者差别有统计学意义(P<0.001，图2B)。依照判定标准，肿瘤组织中ERCC1阳性65例(47.4%)，阴性72例(52.6%)。

2.2癌组织中的ERCC1的表达与病理类型、组织学分级及吸烟的关系 鳞癌组织中ERCC1的表达率(61.4%，35/57)高于其在腺癌组织的表达率(37%，30/80)(P=0.006，表1)，在组织学分级方面，ERCC1的表达率也有统计学差异(P=0.022)，随着分化程度的降低，ERCC1的表达呈增高趋势。另外，吸烟患者癌组织中ERCC1的表达率(62.1%，41/66)高于非吸烟患者(33.8%，24/71)(P=0.001)。肿瘤组织中ERCC1的表达率与年龄、性别、病理分期、T分期、N分期及放化疗史等无关。

A：柱状图；B：箱式图. ☆：P<0.001.图2 ERCC1在癌组织和癌旁组织的H-score评分Fig 2 ERCC1 H-score in the NSCLC tumor and adjacent tissues

2.3ERCC1对NSCLC术后患者预后的影响 在DFS方面，ERCC1表达阳性的患者1，2，3年的DFS率分别为79.5%，70.1%和52.4%，中位DFS时间为22.17月(9.85～34.49月)；ERCC1表达阴性的患者1，2，3年DFS率为85.4%，76.8%和66.8%，中位DFS时间为28.4月(19.34～37.46月)(表2)。Kaplan-Meier生存分析显示，ERCC1阴性患者的DFS优于ERCC1阳性患者(P=0.031，图3A)。在OS方面，ERCC1表达阳性的患者1，2，3年的OS率分别为87.4%，67.5%和64.7%，中位OS时间为51.33月(42.186～61.574月)；ERCC1表达阴性的患者1，2，3年OS率分别为94.2%，87.3%和84.6%。生存分析显示，ERCC1阴性患者的OS优于ERCC1阳性患者(P=0.012，图3B)。

因辅助放化疗的混杂因素的影响，本研究将Ⅱ及Ⅲ期患者数据合并进行亚组分析。ERCC1的表达对于Ⅰ期患者的DFS和OS差别均无统计学意义(表3)；在Ⅱ及Ⅲ期患者中，ERCC1的表达在DFS差别无统计学意义(图3C)，但ERCC1阴性患者的3年OS(73.5%)高于ERCC1阳性的患者(56.4%)(P=0.026，图3D)。

对组织学类型进行亚组分析，结果如表4所示，鳞癌中ERCC1阴性的患者3年的DFS率和OS率分别为40.5%和69.0%，中位DFS时间为33.59月(13.658～53.512月)。鳞癌ERCC1阳性患者3年的DFS率和OS率分别为14.6%和57.1%，中位DFS时间为13.78月(2.631～24.565月)。Kaplan-Meier生存分析显示，鳞癌组织中ERCC1表达阴性的患者DFS和OS均优于ERCC1阳性患者(P=0.041，0.045；图3E，3F)。腺癌中ERCC1阴性的患者3年DFS率和OS率分别为27.1%和82.4%，中位DFS时间为27.97月(17.585～38.351月)；腺癌ERCC1阳性患者3年DFS率和OS率分别为31.9%和73.5%，中位DFS时间为26.27月(13.848～53.302月)。在腺癌组织中，ERCC1的表达与患者的DFS及OS差别均无统计学意义。

表2 ERCC1的表达对NSCLC术后患者预后的影响

NSCLC:非小细胞肺癌； DFS：无病生存； OS：总生存.

DFS：无病生存； OS：总生存. ERCC1对患者DFS(A)和OS(B)的影响；ERCC1对Ⅱ及Ⅲ期患者DFS(C)和OS(D)的影响；ERCC1对鳞癌患者DFS(E)和OS(F)的影响.图3 ERCC1的表达对NSCLC患者预后的影响Fig 3 Effects of ERCC1 expression on the DFS and OS in NSCLC patients

此外，COX回归多因素生存分析结果显示，病理分期是影响患者DFS的唯一独立因素，而病理分期、T分期及ERCC1的表达是影响NSCLC患者OS的独立因素(表5)。

表3 ERCC1对Ⅰ期和Ⅱ+Ⅲ期NSCLC患者预后的影响

NSCLC:非小细胞肺癌； DFS：无病生存； OS：总生存.

表4 ERCC1对NSCLC术后患者鳞癌和腺癌预后的影响

NSCLC:非小细胞肺癌； DFS：无病生存； OS：总生存.

表5 COX回归多因素分析NSCLC术后患者的预后

NSCLC:非小细胞肺癌； DFS：无病生存； OS：总生存.

3 讨 论

含铂方案的两药联合化疗是治疗NSCLC的重要手段之一，但总有效率仅为20%～40%。近年来随着肿瘤分子生物学的发展，在肺癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌的基础研究方面，通过干扰ERCC1的表达能够增强肿瘤细胞对铂类药物的敏感性[8-11]。临床方面Olaussen等通过对Ⅰ～Ⅲ期NSCLC根治术后患者大体标本免疫组织化学染色发现，含铂类的化疗能使ERCC1阴性的患者生存获益，而ERCC1高表达者则不能。提示ERCC1高表达意味着对铂类耐药[12]。Sad等对局部进展期NSCLC化疗研究结果显示，ERCC1阴性的患者总生存期和无进展生存期均优于ERCC1阳性的患者[7]。Hubner等发现，经铂类治疗的NSCLC患者ERCC1高表达强烈提示预后差；在未治患者中却不然；而且ERCC1高表达患者对铂类治疗耐药[13]。因此目前观点认为，ERCC1在局部进展期肺癌患者的含铂类化疗中起着重要的预测作用。本研究结果显示，虽然ERCC1的表达对于NSCLC患者总的3年DFS和OS均有影响(P<0.05)；但对于Ⅰ期患者3年DFS和OS均没有统计学差异。究其原因可能有两点：(1)Ⅰ期患者预后较好，3年随访时间过短；(2)Ⅰ期患者未常规接受术后辅助化疗，故无法反应出ERCC1对化疗的预测作用。对于Ⅱ及Ⅲ期患者，ERCC1只对OS有统计学差异，而对DFS却无影响。由于Ⅱ及Ⅲ期患者术后常规接受全身化疗，提示术后化疗对于ERCC1阴性的患者可能并不能延缓肿瘤的复发，但可延长患者的带瘤生存时间；反之，ERCC1阳性的患者可能意味着肿瘤耐药和化疗失败。

本研究数据还显示，长期吸烟患者中ERCC1的表达率(62.1%)远高于非吸烟患者(37.9%)；肺鳞癌组织中ERCC1的表达率(61.4%)要明显高于肺腺癌组织(37.5%)(P<0.05)，这与Olaussen等报道的ERCC1在鳞癌(55.4%)、腺癌(29.3%)中的表达率相似[12]。预后结果分析也显示，在鳞癌患者中，ERCC1表达阴性的3年DFS率(40.7%)和OS率(68.4%)优于ERCC1表达阳性的患者3年DFS率(14.8%)和OS率(57.7%)，提示ERCC1、吸烟、鳞癌三者之间可能存在某种联系。基础研究已证实，吸烟不仅能诱导DNA损伤从而刺激DNA修复，而且可以诱导小鼠的肺组织内支气管鳞状上皮化生和p-p38的激活[14]，而ERCC1的表达调控与p38信号通路密切相关。研究证实，利用干扰技术或抑制剂阻断p38信号通路能够降低ERCC1的表达，从而增强多种化疗药物的敏感性[15]。目前已有部分p38抑制剂进入Ⅰ～Ⅱ期临床试验，用于治疗自身免疫系统疾病[16-17]。因此p38信号通路或许能够为将来以ERCC1为靶点的抗肿瘤治疗带来新的研究方向。

综上所述，NSCLC肿瘤组织中ERCC1的表达是影响患者预后的重要指标，特别对于Ⅱ及Ⅲ期接受术后辅助化疗的患者，此外ERCC1在鳞癌和吸烟患者肿瘤组织中表达率较高，ERCC1阴性的鳞癌患者预后优于ERCC1阳性的鳞癌患者。

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