沼灌条件下水稻植株中汞及甲基汞的含量及食用风险研究

朱金山，廖敦秀，王定勇，王龙昌，王永敏，尹德良，高润霞

（1.长江师范学院　三峡库区环境监测与灾害防治工程研究中心/武陵山绿色发展协同创新中心，重庆　408100；2.重庆市农业科学院，重庆　401329；3.西南大学　农学与生物科技学院/资源环境学院，重庆　400715；4.重庆地质矿产研究院，重庆　400042）

汞（Hg）是一种神经毒素。暴露在环境中的汞可能引起重大的健康风险，包括对肾脏、心脏和呼吸系统造成损害，引起震颤、皮疹、视力和听力障碍，头痛、无力、记忆力衰退以及情绪变化[1]。更严重的是，它可以转化成毒性更强的甲基汞（MeHg），富集到食物链，最终进入人体威胁人类的健康。MeHg主要侵犯中枢神经系统，可造成语言和记忆能力障碍等，典型代表为水俣病。

在陆地生态系统中，土壤是自然环境中汞迁移转化的重要环节，同时也是植物汞的重要来源。稻田由于常年积水，成为最重要、最充盈的人工湿地系统之一[2]。稻田在地区汞的生物地球化学循环中起着重要的作用。一方面，由于稻田水体含有丰富的可溶性碳（Dissolved Organic Carbon，DOC）和腐殖酸，它们能与汞生成稳定的络合物，因而稻田能够吸收大气沉降和径流输入的汞，成为汞的活性库。另一方面，稻田中碳的累积也为甲基化细菌的生存提供了理想的条件，成倍增加汞的甲基化作用。因此导致稻田Hg污染和稻米中总汞和MeHg的积累加剧。

根据FAO（World Food Organization）的数据显示，在所有粮食作物中，以稻米消费量最大。中国是世界上最大的稻米产区，稻米产量占世界稻米产量的30.7%[3]。我国南方是稻米主产区，据统计2009年南方地区稻米栽培面积占全国的93%[4]。2012年，由孟博早期研究发现，我国西南汞矿区食用稻米是农村居民甲基汞暴露的主要途径，这一研究成果打破了传统的“食用鱼类等水产品是人体甲基汞暴露的主要途径”的国际共识[5]。

畜禽粪便中汞的污染不容忽视。如张彪等[6]对采自山东禹城几个畜禽养殖基地的畜禽粪便进行了测定，结果表明，牛粪中总汞的含量为0.085～0.094 mg/kg，鸡粪中总汞的含量为0.074～0.086 mg/kg，猪粪中总汞的含量为 0.103～0.107 mg/kg。Hölzel等[7]测定了德国305份猪粪样品总汞含量的范围是0.01～0.11 mg/kg。

由于沼液是畜禽粪便经过厌氧发酵后的副产品，因此，沼液中的汞含量也较高[8-9]。刘思辰等[10]通过收集和监测全国21个省份户用沼气池和沼气工程近100个沼液样品的重金属含量数据表明，户用沼液中汞含量的范围为0.3×10-3～0.152 mg/L，中值为0.025 mg/L，均值为0.049±0.05 mg/L。沼气工程沼液中汞含量的范围为0.04×10-3～4.177 mg/L，中值为0.004 mg/L，均值为0.301±0.95 mg/L。李健和郑时选[11]也报道了经不同饲料（配合饲料和青饲料）喂猪后其粪便厌氧发酵所产沼液中汞的含量分别为0.122 mg/L和0.043 mg/L。

沼液是厌氧发酵的产物，具有较强的还原能力[12]，同时，厌氧环境中占优势的硫酸盐还原菌（SRB）的数量较多，活性较强，都会随沼液进入稻田。SRB是目前发现的主要的汞甲基化细菌，也是报道最多的汞甲基化细菌。沼液稻田浇灌的过程中，造成稻田严重水体富营养化，导致有机质增加，水中溶解氧下降、水体呈厌氧还原环境，为SRB的生长提供了有利条件，同时，稻田水体溶解性有机质含量的增加可刺激SRB的甲基化活性。

沼液稻田消纳的过程中，一方面增加了稻田中汞的负荷；另一方面使稻田水体中能够影响汞迁移转化的重要因素如pH、氧化还原电位（ORP）、SRB细菌的数量和活性、温度、DOC的含量等都发生剧烈的变化，进而影响汞在沼液消纳稻田中的行为及归趋。

基于此，本文通过对典型沼灌稻田土壤和水稻植株不同部位中Hg及MeHg含量的测定，研究沼灌和非沼灌条件下，稻田土壤和水稻植株中汞和甲基汞的含量水平和分布特征，也对沼灌可能带来的人群Hg及MeHg暴露风险进行了评估。其结果对合理利用和开发沼液，确保沼灌区水稻生产安全具有重要的现实意义，可为环境决策和环境管理提供科学依据。

1　材料与方法

1.1　采样点基本情况

选择了3个典型的长期沼灌监测点进行系统的采样和分析。采样点1位于重庆市长寿区某粪污处理沼气工程周边的稻田。该稻田属于冬水田，每年只种一季水稻，冬季为稻田蓄水期。该区域属亚热带湿润季风气候，四季分明，冬暖春早，初夏多雨，盛夏炎热常伏旱，秋多连绵阴雨，无霜期长，温差大，多雾少日照。常年平均气温17℃，常年降水量1 000 mm以上。当地常规稻田施肥方式为氮肥 （N）用量150 kg/hm2、磷肥（P2O5） 60 kg/hm2；钾肥（K2O）约60 kg/hm2。沼液在稻田冬闲期一次性灌入，每亩灌入量约为20 t。采样点2位于江苏省常州市某沼气工程。该沼气工程采用CSTR发酵工艺，以猪场粪便、污水和农作物秸秆粉碎物为发酵原料。该区域属于亚热带海洋性气候，水稻生育期为5月下旬到11月上旬，温度适宜（常年≥10℃，总积温4 000℃以上），雨量充沛（600～900 mm）、太阳辐射充足(1 300 h)，当地常规稻田施肥方式为氮肥（N）用量270 kg/hm2、磷肥（P2O5）30～60kg/hm2、钾肥（K2O）约135 kg/hm2、沼液在插秧前期一次性施入，施入量为75～120 t/hm2。采样点3位于浙江省宁波市某沼液综合利用区域，沼液以猪场粪便为发酵原料。该区域属亚热带季风性湿润气候，春秋两季雨量均衡，冷热适中，年平均气温16.2℃，年均降水量1 500 mm左右，年均日照达2 000 h，水稻生育期为5月中上旬到10月上旬，当地常规稻田施肥方式为氮肥（N）用量187.5～225 kg/hm2、磷肥（P2O5）90～120 kg/hm2、钾肥 （K2O） 约 180～225 kg/hm2，在水稻定植前分多次施入沼液，施入量375～450 t/hm2。

1.2　样品的采集与保存

分别于2016年8月6日、10月22日、10月16日系统采集了3个典型沼灌稻田采样点的土壤和水稻植株样品。同时，对当地常规施肥稻田的土壤和水稻植株样品进行了采集。低温冷藏带回实验室，冷藏待分析。

1.3　样品中总汞及甲基汞含量的测定

土壤总汞含量的测定：称取经风干、磨细并过0.149 mm孔径筛的土壤样品0.5 g，经王水消解后，加入0.5 mL的BrCl密封，静置24 h，用NH2OH·HCl去除游离态卤素，去离子水定容至50 mL，吸取5～10 mL，经AFS9700原子荧光光度计测定。GBW07428（GSS-14）作为土壤中汞的标准物质。

水稻植株样品经80℃烘干，磨碎后，称取0.5～1.0 g，加入HNO3∶H2SO4=8∶2（V/V）混合酸10 mL，水浴3 h（温度 95℃）后，加入0.5 mL的BrCl密封，静置24 h，NH2OH·HCl去除游离态卤素，去离子水定容，称取5～10 mL，经AFS9700原子荧光光度计测定。

样品MeHg含量的测定：称取0.5 g土壤样品（磨细）到35 mL Teflon离心管中，加入5 mL（18%KBr+5%H2SO4）溶液，加入1 mL 1 mol/L CuSO4；室温下消解1 h；加入10 mL二氯甲烷（DCM），盖紧盖子；每隔5 min，摇匀离心管，共10 min；将离心管放入离心机中，转速为3 000 r/min，持续30 min；移取2 mL有机层中（DCM）溶液至含有刻度的50 mL聚丙烯管中，加入45 mL去离子水及特氟龙防爆沸碎片，电热板加热至70℃，持续3 h，直至DCM层去除；加入去离子水定容至50 mL（该样品在48 h内分析）；加入30 mL样品溶液于40 mL棕色样品瓶中，加入去离子水至瓶颈处，加入0.3 mL醋酸缓冲液，加入50µL乙基化试剂，加入蒸馏水至瓶满，盖紧盖子，摇匀，静置10～15 min，等待上机分析。用沉积物标准参考物质ERM-CC580作为甲基汞的标准物质[13]。

称取0.2 g水稻植株样品（小颗粒），测定重量，加入含有刻度的50 mL聚丙烯管中；加入2 mL 25%KOH甲醇溶液；盖紧盖子，涡旋10～15 s，电热板加热至60℃，每隔2 h涡旋10～15 s，持续4 h；加入去离子水8 mL，摇匀，冷冻样品进行保存；分析当日，解冻样品，放入离心机中，转速为4 000 r/min，持续10 min；对于全自动甲基汞仪器来说，添加上清液样品溶液1 mL于40 mL棕色样品瓶中，添加35～37 mL去离子水至瓶颈处，加入0.3 mL醋酸缓冲液，加入50µL乙基化试剂，加入蒸馏水至瓶满，盖紧盖子，摇匀，静置10～15 min，等待上机分析[14]。

1.4　数据的统计分析

数据的分析处理采用Excel 2003完成，部分图片使用软件origin 8.0制作。

2　结果与讨论

2.1　水稻籽粒中汞及甲基汞的含量

对三个沼灌稻田采样点水稻籽粒中汞的含量测定结果表明，籽粒中汞含量为7.11～15.32µg/kg，平均值为10.81µg/kg，中值为10.30µg/kg。其中长寿采样点水稻籽粒中汞的含量为8.62±4.99µg/kg，江苏采样点水稻籽粒中汞的含量为12.50±2.18µg/kg，浙江采样点水稻籽粒中汞的含量为8.75±1.93µg/kg。与之相对应的常规稻田水稻籽粒中总汞的含量范围为3.34～29.42 µg/kg，均值为10.83 µg/kg，中值为11.36µg/kg。可以看出，水稻籽粒中总汞的含量总体处于较低水平，均值均低于国家食品中污染物限量标准对粮食中总汞的限量标准20µg/kg。

对三个沼灌稻田采样点水稻籽粒中甲基汞的含量测定结果表明，籽粒中甲基汞含量的范围为0.38～3.51 µg/kg，平均值为1.63 µg/kg，中值为1.12µg/kg。长寿采样点水稻籽粒甲基汞的含量为0.86±0.41µg/kg；江苏采样点水稻籽粒甲基汞的含量为2.46±1.15µg/kg；浙江采样点水稻籽粒中甲基汞的含量为0.57±0.16µg/kg。与之相对应的常规稻田水稻籽粒中总汞的含量范围为0.15～2.94µg/kg，均值为1.33µg/kg，中值为0.98µg/kg。总体来看，沼灌稻田水稻籽粒中甲基汞的含量略高于常规稻田。

土壤中的甲基汞很可能是水稻中甲基汞的主要来源，而其含量的高低对水稻甲基汞含量水平有重要影响[5]。沼灌稻田土壤中甲基汞的含量与对应的水稻籽粒中甲基汞的含量的关系见图1。从图中可以看出二者呈线性关系，土壤中甲基汞含量越高，水稻籽粒中甲基汞的含量也越高。相关分析的结果也表明，沼灌稻田土壤中甲基汞的含量与对应的水稻籽粒中的甲基汞含量之间存在显著正相关关系（r=0.580*，P=0.048，n=12）。

水稻籽粒中甲基汞占总汞的比例的范围为1.68%～32.57%，均值为13.09%，中值为10.15%。籽粒甲基汞含量较高的样品甲基汞占总汞比例也较高，二者存在一定的正相关关系（r=0.550，P=0.064，n=12）。水稻籽粒中甲基汞的含量与总汞的含量存在极显著的正相关关系（r=0.824**，P=0.001，n=12），如图2所示。

图1　沼灌稻田土壤中甲基汞的含量与对应的水稻籽粒中的甲基汞含量的关系Fig.1　The relationship between methylmercury in paddy soil and rice with different irrigation time by biogas slurry

图2　沼灌稻田水稻籽粒中甲基汞的含量与总汞含量的关系Fig.2　The relationship between methylmercury and mercury in paddy soil with different irrigation time by biogas slurry

2.2　水稻植株中汞及甲基汞的分布特征

三个采样点水稻植株各部位汞含量见表1和图3。总体来看水稻植株各部位汞含量表现为根＞叶＞茎＞籽粒。根是水稻植株中汞蓄积的主要部位，土壤中的活性汞可能先通过根部进入水稻体内，再向其他部位迁移。袁尔立等[15]通过水稻施汞盆栽实验发现，HgCl2处理的水稻各器官总汞含量依次是根＞叶＞籽实＞茎，原因可能在于汞作为水稻非必需营养元素，在水稻体内的迁移必然从属于其他必需元素，水稻各组织器官在吸收必需营养元素的同时附带吸收汞，因而水稻新陈代谢最旺盛的器官根和叶中汞含量最大，而在营养储藏的部位米粒中含量最低[16]。土壤中的活性汞还可能与根蛋白疏基结合，将汞固着在根部，进而减少汞离子向水稻其他部位的迁移。崔瑞平[17]对丹寨汞矿废水灌溉的稻田水稻植株中汞含量的测定结果表明，稻根汞含量最大，而籽粒汞含量最低，表现出自下而上递减的变化规律，这与本文对沼灌稻田中水稻植株各部位汞含量的测定结果相一致。

表1　植株各部位汞的含量Table 1　The concentration of total mercury in rice plant

图3　长期沼灌稻田水稻植株中汞的含量Fig.3　The concentration of total mercury in rice plant with long time irrigation by biogas slurry

三个采样点水稻植株各部位甲基汞的含量见表2和图4。总体来看，三个采样点水稻植株各部位甲基汞的含量表现为籽粒＞根＞茎＞叶。这与袁尔立等[15]水稻施汞盆栽实验的结果及黄中伟[18]对河南信阳稻田水稻样品的测试结果相一致。本文中，江苏常州采样点籽粒中甲基汞的含量明显高于其他两个采样点，达到了2.46±1.15µg/kg，这可能与当地土壤汞的背景及水稻品种有关。但孟梅等[19]对贵州、湖南、广东等地10个汞矿区150份完整的水稻植株各部位甲基汞的含量的测定表明，甲基汞在水稻中浓度分布整体趋势为根＞米粒＞茎叶＞稻壳，也进一步说明，籽粒中累积的甲基汞主要来源于根对土壤中甲基汞的吸收，这也印证了本文中沼灌稻田土壤中甲基汞的含量与对应的水稻籽粒中甲基汞含量之间存在的强相关关系。

表2　植株各部位甲基汞的含量Table 2　The concentration of methylmercury in rice plant

图4　长期沼灌稻田水稻植株中甲基汞的含量Fig.4　The concentration of methylmercury in rice plant with long time irrigation by biogas slurry

三个采样点水稻植株各部位甲基汞占总汞的比例见表3和图5。总体来看，水稻植株各部位甲基汞占总汞的比例表现为籽粒最大。Meng等[20-21]通过同步辐射—X射线荧光微区谱学成像技术研究了稻米中汞和甲基汞的分布，发现相对于胚乳，稻米中汞（主要为无机汞）强烈富集在糙米表层，对应为果皮和糊粉层，推测稻米中的无机汞主要是与半胱氨酸结合，并以植物螯合肽的形式存在。而甲基汞主要赋存于蛋白质中，且在水稻生长期间这部分甲基汞会随蛋白质一起发生明显的运移，最终被储存在精米中。

表3　植株各部位甲基汞占总汞的比例Table 3　The proportion of MMHg/THg in rice plant

图5　长期沼灌稻田水稻植株各部位甲基汞占总汞的比例Fig.5　The proportion of MMHg/THg in rice plant with long time irrigation by biogas slurry

袁尔立等[15]通过水稻施汞盆栽实验发现，添加氯化汞作为汞污染源的处理，籽实中甲基汞可达总汞量的80%以上（81.9%），茎中可达28.9%，稻叶和稻根中的比例可达5.3%和2.3%。认为植物器官积累甲基汞的主要因子是富-SH基的蛋白质，而调查中也发现油料作物的籽实中甲基汞的含量远超过蛋白质含量较低的糙米，也证实了这一推测的可能性。袁晓博等[22]对我国9个省份大米中汞和甲基汞含量测定结果表明，大米中甲基汞占总汞的比例范围为1.7%～97%，均值为36%±24%。相比较而言，沼灌区稻米中甲基汞占总汞的比例还较低。

2.3　水稻籽粒中汞及甲基汞暴露的健康风险评估

在汞及甲基汞毒性与人体健康效应之间的关系方面，美国环境保护署（EPA）建立的甲基汞参考剂量（reference dose，RfD）以及世界卫生组织（WHO）和联合国粮食与农业组织（FAO）联合制定的总汞及甲基汞临时性每周允许摄入量（provisional tolerable weekly intake，PTWI）是2个国际公认的甲基汞暴露定量衡量指标[23-24]。WHO和FAO联合制定的专门针对敏感人群的总汞PTWI为5µg/kg，甲基汞PTWI为1.6µg/kg；EPA规定的每日甲基汞RfD为0.1µg/kg。

当地居民大米汞和甲基汞的周摄入量（PWI）可按如下公式计算[22]：

假设当地居民日常食用的大米均为自己种植，每周大米食用量（IR）按2.13 kg[25]，居民人均体重（bw）为60 kg。由此计算可得沼灌区居民大米总汞每周摄入量的范围为0.25～0.55µg/kg，占PTWI的比例为5.06%～10.90%。总汞每周摄入量均值为0.38µg/kg，占PTWI的比例为7.69%。长寿沼灌区居民大米总汞每周摄入量为0.31µg/kg，占PTWI的比例为6.13%；江苏沼灌区居民大米总汞每周摄入量为0.45µg/kg，占PTWI的比例为8.89%；浙江沼灌区居民大米总汞每周摄入量为0.31µg/kg，占PTWI的比例为6.22%。

由此计算可得沼灌区居民大米甲基汞每周摄入量的范围为0.014～0.130µg/kg，占PTWI的比例为1.93%～17.83%。甲基汞每周摄入量均值为0.058µg/kg，占PTWI的比例为8.28%。长寿沼灌区居民大米甲基汞每周摄入量为0.031µg/kg，占PTWI的比例为4.37%；江苏沼灌区居民大米甲基汞每周摄入量为0.088µg/kg，占PTWI的比例为12.50%；浙江沼灌区居民大米总汞每周摄入量为0.020µg/kg，占PTWI的比例为2.90%。

综上所述，沼灌区稻米中总汞和甲基汞对当地居民健康风险贡献分别为5.06%～10.90%和1.93%～17.83%，说明沼灌区居民均存在通过食用稻米汞及甲基汞暴露的风险，但风险较低。

3　结论

（1）沼灌区水稻籽粒中汞的含量总体处于较低的水平，籽粒中甲基汞的含量略高于常规稻田，当地居民存在食用稻米的汞及甲基汞暴露的风险。

（2）沼灌区水稻植株各部位汞的含量表现为根＞叶＞茎＞籽粒，甲基汞的含量表现为籽粒＞根＞茎＞叶，同时籽粒中甲基汞占总汞的比例也高于其他器官。

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