血清硫酸吲哚酚水平与冠心病严重程度的关系研究

潘海林　李锋进　郭凯

1惠州市中心人民医院心血管内科（广东惠州 516000）；2龙岩市第一医院全科医学科（福建龙岩364000）；3南方医科大学南方医院心血管病内科（广州 510280）

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）患者的心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的发病率和病死率较高。越来越多的研究［1］表明，CKD与冠心病（coronary artery disease，CAD）有部分共同的病理过程并且相互影响。冠状动脉损伤是由于某些介质对于血管产生的直接毒副作用，如随着肾功能的恶化产生的尿毒症毒素［2-3］。蛋白质结合的尿毒症保留溶质是一系列的难以被透析清除的尿毒症毒素，他们中的大多数在CKD患者体内聚集，干扰体内的代谢系统，并且在炎症中发挥着作用，导致心血管的损伤，加速动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）过程［4-6］。硫酸吲哚酚（indoxyl sulfate，IS）是一种蛋白结合的尿毒症保留溶质，是吲哚在肝脏中代谢而成的一种有机阴离子［7］。研究［8-16］表明，IS对 AS的多项病理过程有作用，如抑制伤口的愈合和人脐静脉内皮细胞（ECs）的增殖，增强活性氧（ROS）的产生，增加NAD（P）H的氧活性，通过激活细胞外调节蛋白激酶（ERK）导致血管平滑肌（VSMCs）增殖，诱导纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI⁃1）和激活人肾小管上皮细胞的核因子（NF⁃κB）。另外，研究［12］表明，2型糖尿病和CAD患者的血清IS明显升高，这种升高与肾功能的退化，炎症和冠状动脉粥样硬化有关。以上IS的毒副作用研究支持IS是心血管风险因素之一，并且与CAD的发生发展有关。但目前，血清IS水平与CAD患者的病情严重程度的研究相对较少。本研究目的旨在研究这个假说，即血清IS水平和稳定型冠心病（CAD）患者的病变血管数，钙化分数，Gensini积分等有关，并且血清IS水平可能也与其他心血管风险因素有关。

1　对象与方法

1.1研究对象连续收集2016年1月1日至2017年7月1日期间在惠州市中心人民医院、龙岩市人民医院以及南方医科大学南方医院的患者共503例，所有患者均为首次接受冠状动脉造影检查，根据冠脉造影检查将患者分为稳定型心绞痛组（CAD组）和冠脉正常组（非CAD组）。稳定型心绞痛的诊断标准为：根据2007年《慢性稳定型心绞痛诊断和治疗标准》，稳定型心绞痛患者为在冠状动脉主要分支狭窄≥50%的基础上，伴有劳力性胸痛，且6个月内无胸痛性质恶化以及静息性胸痛。排除标准：伴有炎症疾病（例如炎症、脓毒血症、恶性肿瘤、肝脏疾病和胶原疾病等）、应用固醇类激素、近期需要进行外科手术、既往有冠脉介入或者冠脉搭桥史、严重瓣膜病、严重肝肾功能损害、甲状腺功能异常、血液系统性疾病患者。本研究收集所有入选患者的详细人口统计学资料，临床资料，血液学资料以及冠状动脉造影资料。2型糖尿病的诊断根据中国2型糖尿病防治指南（2013年版）［17］，即：空腹血糖 ≥ 7.0 mmol/L或葡萄糖负荷后2 h血糖≥11.1 mmol/L或糖尿病症状情况下，随机血糖≥11.1 mmol/L。原发性高血压的诊断根据中国高血压防治指南（2010年版）［18］，即在安静情况下至少2次重复测量血压≥140/90 mmHg。吸烟定义为平均每天至少1支烟规律吸烟至少1年。

1.2实验室检查所有受试者的血液在测量IS前，均离心并且取上清后分装冻存。血肌酐、尿酸和血脂检测均采取标准方法，且均在冠状动脉造影前。肾功能指标为肾小球滤过率（eGFR），其计算根据肾脏饮食公式（MDRD）［19］。在测量血清IS前，将甲醇和血清按3∶1的比例混合，使用Waters Acquity超高效液相色谱法系统（UPLC）对其进行检测。其余实验室生化指标均参照常规标准。

1.3冠状动脉评估冠脉造影检测根据常规标准和方法，斑块的严重程度使用定量冠脉造影系统进行评估。冠状动脉造影检查所有入选者均采用Judkins法多体位造影，左冠状动脉常规采用6个体位（足位，头位，右肩位，左肩位，左足位，右足位），右冠状动脉常规采用2个体位（左前斜和头位，部分患者加做左头位及右前斜）。并根据美国心脏病协会的冠状动脉分段评价标准，采用Gensini积分系统，由2名有经验的医师对其造影结果进行重新评估。以每支冠状动脉血管最严重狭窄程度进行定量评定，直径狭窄＜25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计4分，76%～90%计8分，91%～99%计16分，完全闭塞计32分。根据不同冠状动脉乘以相应系数，左主干病变×5；左前降支病变：近端× 2.5，中端× 1.5，远端× 1；对角支病变：D1×1，D2×0.5，左旋回支病变：近端 ×2.5，远端×1；后降支 ×1，后侧支 ×0.5；右冠状动脉病变：近、中、远和后降支均×1，各狭窄冠脉积分之和即为Gensini积分。使用CAC评分软件计算Ag⁃atston评分。每个斑块的Agatston钙化评分是通过将冠状动脉钙化面积乘以斑块的峰值信号的加权因子所得。每个斑块的相加得出总的Agatston钙化评分。通过将钙化的病变（以平方毫米测量）的面积乘以截面厚度来计算总钙化体积。

1.4统计学方法使用Kolmogorov⁃Smirnov检测方法对数据是否符合正态分布进行检测。符合正态分布的数据使用均数±标准差的形式进行描述，不符合正态分布的数据使用中位数（四分位数）进行描述。对于正态分布的数据，两组间比较统计学差异检测使用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。计数资料采用χ2检验。使用多因素的Logistic回归分析对变量是否独立与CAD的发生相关进行分析。使用非CAD组作为对照，IS与CAD的严重程度关系的分析使用Logistic回归分析。计算与冠状动脉疾病严重程度相关的多变量调整优势比（OR）。多变量调整的ORs使用95%可信区间（CI）的方式表示。IS与其他心血管风险因素的关系使用Spearman相关分析进行检测。应用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计分析。所有P值均为双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1水清IS水平与冠状动脉狭窄程度有关患者的基线临床资料、生化和冠脉造影指标等均见表1。CAD患者组的男性较多，平均年龄较大，有更多的吸烟者、高血压患者、高脂血症患者以及糖尿病患者。并且CAD组较非CAD组血糖、三酰甘油、尿酸、血肌酐以及Gensini积分均较高，而TC、HDL⁃C、白蛋白水平以及eGFR均较低。而两组BMI、收缩压、舒张压、LDL⁃C和总的白细胞水平差异无统计学意义。研究显示：血清IS水平与性别无关（P＞0.05）。心血管疾病的传统风险因素除了糖尿病外均与血清IS水平无关（数据未列出）。而年龄与血清IS水平明显相关（β=0、327，P＜0.000 1，n=303）。267例CAD患者根据病变累及血管支数，进一步分为1支病变组、2支病变组和3支病变组。CAD组患者的血清IS水平明显高于非CAD组患者［0.55 mg/L（0.23～ 1.53）vs.0.50 mg/L（0.23～0.83），P=0.026］。并且随着病变支数的增多，血清IS水平亦升高（P＜0.05）。

表1　受试者的临床基线资料和生化学指标Tab.1　Baseline clinical and biochemical characteristics of the study population　±s，例（%），M（P25～ P75）

表1　受试者的临床基线资料和生化学指标Tab.1　Baseline clinical and biochemical characteristics of the study population　±s，例（%），M（P25～ P75）

注：数据使用均数±标准差或中位数进行描述

变量性别（男/女）年龄（岁）BMI（kg/m2）高血压高脂血症糖尿病吸烟收缩压（mmHg）舒张压（mmHg）血糖（mg/dL）TC（mg/dL）TG（mg/dL）HDL⁃C（mg/dL）LDL⁃C（mg/dL）尿酸（mg/dL）血肌酐（mg/dL）白蛋白（g/dL）eGFR［mL/（min·1.73m2）］白细胞总数（×109/L）IS（mg/L）病变血管支数（例）总数（n=503）292/213 62.6±10.2 25.4±4.0 355（70.6）315（62.6）158（31.4）177（35.2）134±22 76±11 123.0±54.0 181.2±47.7 107.0（75.0 ～ 155.3）42.0±13.2 110.3±39.2 6.3±1.8 1.20±0.49 4.0±0.4 65.9±20.3 6.657±2.017 0.49（0.23 ～ 1.25）CAD组（n=267）196/71 64.8±10.2 25.8±4.0 230（86.1）196（73.4）121（45.3）125（46.8）135±22 75±10 138.4±62.7 171.5±42.2 116.5（85.3 ～ 172.8）38.5±11.6 106.2±37.5 6.8±1.9 1.37±0.53 4.0±0.4 57.6±16.9 6.849±2.135 0.55（0.23 ～ 1.53）非CAD组（n=246）124/142 59.2±9.4 24.8±3.9 113（45.9）114（46.3）23（9.3）40（16.3）132±22 77±12 100.1±23.5 196.3±51.9 94.5（64.3 ～ 136.3）48.0±13.8 117.3±41.4 5.7±1.4 0.93±0.25 4.1±0.3 79.1±18.2 6.361±1.794 0.50（0.23 ～ 0.83）P值＜0.000 1 0.000 2 0.099＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 0.457 0.157＜0.000 1 0.000 4 0.014＜0.000 1 0.065＜0.000 1＜0.000 1 0.040＜0.000 1 0.108 0.026 0123 91 84 92 246斑块位置左前降支左回旋支右冠状动脉GS＜0.0001 15.5（0.0 ～ 56.0）137 112 109 36.0（17.0 ～ 83.0）0.0（0.0 ～ 0.0）

2.2血清IS水平与CAD的发生风险相关包括血清IS水平、传统心血管疾病风险因素以及其他生化指标在内的多因素Logistic回归分析见表2，血清IS水平、BMI、高血压、糖尿病、HDL⁃C、尿酸、eGFR分别与CAD独立相关。这说明血清IS水平是CAD发生的风险因素之一。同时，简单和多因素Logistic回归分析发现，血清IS水平与病变血管支数相关。完全调整比值比（OR）的多重Logistic回归分析显示，与一支、两支、三支血管的OR值分别为0.351（95%CI：0.059 ～ 2.093），3.011（95%CI：1.004 ～ 9.751）和3.076（95%CI：1.138 ～ 8.310）。见表3。

表2　CAD风险和血清IS水平以及其他心血管风险因素的相关性Tab.2　Association of risk of coronary artery disease with indoxyl sulfate and other cardiovascular risk factors

表3　血清IS水平对于CAD严重程度的影响Tab.3　Te impact of serum indoxyl sulfate levels on the severity of coronary artery disease

2.3血清IS水平与心血管其他风险因素有关使用Spearman相关分析对血清IS水平心血管风险因素、钙化积分、Gensini积分以及Framingham 10年风险积分的相关性。结果显示：血清IS水平与年龄、冠状动脉钙化积分、体积钙化积分、Gensini积分以及Framingham 10年风险积分正相关。另外，血清IS水平与eGFR负相关（表4）。

3　讨论

本研究首次证实了与非CAD患者相比，CAD患者的血清IS水平较高，并且血清IS水平与CAD的严重程度（Gensini积分、钙化积分、冠脉斑块以及Framingham 10年风险积分）明显正相关，与eG⁃FR明显负相关。

IS最初被认为是由于肾功能不全产生的尿毒症保留溶质。在CKD大鼠模型中，IS可以通过促进TGF⁃1β、TIMP⁃1和 Pro⁃α1 胶原的表达，以及复杂的氧化还原反应，导致肾小球硬化以及肾间质的纤维化［21-23］。IS也可以增加血管平滑肌细胞增生［15］，激活血小板源生长因子受体以及MAPK通路［10］，导致内皮和血管功能紊乱。临床方面，血清IS水平与增加的动脉钙化和血管增厚有关［2］。有研究［2］表明，血清IS水平的增加与CKD患者的心血管死亡风险有关。泡沫细胞的形成是AS发生发展的关键。本研究团队的前期研究也说明了，IS可以通过下调THP⁃1源性泡沫细胞的ABCA1、ABCG1和SR⁃B1蛋白表达，从而减少胆固醇流出率，抑制泡沫细胞的形成。该研究结果证实了，与非CAD患者相比，CAD患者的血清IS水平较高，平且随着病变程度的加重［20-21］，如Gensini积分、钙化积分、冠脉斑块以及Framingham 10年风险积分，其血清IS水平也会随之上升。这与之前关于IS与内皮损伤和心血管风险相关的报道一致［2，9］。众所周知，轻中度的肾功能减退是冠心病的独立风险因素，并且与患者心血管事件发生风险呈负相关［22］，这与笔者的研究结果一致。笔者的研究亦发现，与非CAD组患者相比，CAD患者的肾功能相对减退，如血肌酐水平升高，eGFR降低。IS作为一种蛋白结合的尿毒症保留溶质，在CKD患者的血液和组织中大量聚集，其浓度常超过500 μm，而肾功能正常的患者中，其浓度为0.1 ～ 2.39 μm［23］。IS对于AS进展的促进作用，既解释了IS浓度与患者冠脉狭窄程度有关，也从一定程度上解释了，CKD患者的CAD以及心血管事件的发生风险更高。

表4　血清IS水平与心血管风险因素、钙化积分、Gensini积分以及Framingham 10年风险积分的相关性Tab.4　Spearman rank correlation coefficients between indoxyl sulfate and cardiovascular risk factors，calcium score，Gensini score and Framingham risk score

尽管该研究证实了，高血清IS水平与冠脉动脉粥样硬化进展有关，但是具体机制仍然不清。除了巨噬细胞，血管内皮细胞和血管平滑肌细胞也在AS的发生发展中发挥着重要作用。首先，IS作为一种促炎因子可以诱导内皮细胞损伤［8-9，24］。其次，IS可以通过增加人脐静脉内皮细胞（HUVEC）微分子，从而损伤内皮，并且抑制HUVEC的增殖和迁移［22］。IS还可以诱导ROS的产生，增强PDGF诱导的VSMCs的增值和迁移。总之研究表明，IS可以诱导自由基或微分子的产生，损伤内皮，激活NADPH氧化等减少内皮抗氧化能力以及增强平滑肌细胞增殖的能力，这些都是冠状动脉粥样硬化的始动过程。这有可能是IS与CAD严重程度相关的机制之一。

本研究也有一定的局限性。首先对于IS和CAD的关系，本研究属于横断面研究，而非多中心前瞻性的随机对照研究，其说服力欠佳。另外，对于血清IS的检测，本研究采用了单一的HPLC的方法，没有采用多种其他方法进行验证。因此，为了增强说服力，需要进一步的采用多中心前瞻性的随机对照研究，并增加随访。

总之，稳定型CAD患者升高的IS水平与病变血管支数以及斑块符合指标有关。因此，IS不仅在CAD的发生发展中扮演着重要的角色，而且对于预测CAD的发生以及严重性的评估也有一定的参考价值。

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