LncRNA NNT-AS1对胃癌细胞增殖、凋亡作用机制研究

帅勇锋　王小军　张一中

胃癌是世界范围内常见的恶性肿瘤，发病率在所有肿瘤中排第4位，病死率排第2位；据统计，2012年全球共有951 600人诊断为胃癌，723 100人死于胃癌[1]。约70%的胃癌病例发生于发展中国家，以55～80岁人群高发，5年生存率为10%～30%[2]；而日本得益于早发现、早诊断、早手术，胃癌的5年生存率为50%～70%[3]。深入研究胃癌的发病机制对研制有效的治疗药物，提高治疗效果具有重要意义。长链非编码RNA（Long non-coding RNAs，LncRNAs）是一类长度超过200个核甘酸的RNA，不具有编码蛋白质的功能，其可通过染色质重塑介导基因的沉默或激活[4]，在肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、转移等过程中起重要作用[5-6]。LncRNA NNT-AS1由5p12染色体编码，在结肠癌细胞中高表达，下调LncRNA NNT-AS1表达可降低结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力[7]。然而，LncRNA NNT-AS1在胃癌发生、发展过程中所起的作用，目前报道少见。本实验在体外条件下研究LncRNA NNT-AS1对胃癌细胞增殖、凋亡的作用机制，以供临床参考，现报道如下。

1　材料和方法

1.1材料正常人胃成纤维细胞系NSFC、胃癌细胞系KATO-Ⅲ、NUGC-3、AGS、N87均购自中国医学科学院，DMEM培养基、FBS、胰蛋白酶均购自美国Gibco公司，Trizol购自美国Invitrogen公司；Western blot所用一抗购自美国BD公司，HRP标记的二抗购自英国Abcam公司；罗氏HP DNA转染试剂、polybrane购自Sigma公司，慢病毒及转染序列设计由广州锐博生物科技有限公司完成。

1.2方法

1.2.1慢病毒包装与感染取慢病毒包装质粒1.5μg、shRNA慢病毒质粒0.5μg，用罗氏转染试剂以DNA（μg）：转染试剂（μl）为1∶2的比例，共转染至接种于6孔板的HEK293T细胞中，转染48h后，收集细胞培养液，即慢病毒液。此慢病毒液可直接感染KATO-Ⅲ细胞，加入终浓度为8μg/ml的polybrane，慢病毒感染24h后，更换新鲜培养基，继续培养24h，加入puromycin筛选3～5d，待细胞不死亡，即提示稳定细胞株构建成功。

1.2.2细胞培养、慢病毒感染及分组将胃癌细胞系KATO-Ⅲ、NUGC-3、AGS、N87及正常人胃成纤维细胞系NSFC培养于含10%FBS、1%双抗的RPMI1640培养基中，于5%二氧化碳、37℃条件下培养。将KATO-Ⅲ细胞系分成对照组、sh-vector组及sh-NNT-AS1组共3组，分别不感染慢病毒、感染阴性shRNA慢病毒及感染lenti-sh-NNT-AS1慢病毒，构建成稳定细胞株后进行后续实验。

1.2.3RNA提取和实时荧光定量PCR检测LncRNA NNT-AS1采用Trizol提取细胞总RNA，并按TaqMan RNA reverse transcription kit（ABI,USA）说明书，将5ng的总RNA逆转录合成cDNA。在ABI 7500实时荧光定量PCR仪中，使用SYBR Green PCR master mix试剂（Roche,USA），以β-actin作为内参，量化LncRNA NNTAS1的表达水平。选取的引物如下：LncRNA NNT-AS1上游引物5′-TGAAGTTTTCAGGGACACAT-3′，下游引物5′-TTTAGACCTGTTTCTTTGTT-3′；β-actin正向引物5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，反向引物3′-CTAAGTCATAGTCC-GCCTAGAAGCA-5′，使用2-ΔΔCt方法定量，计算LncRNA NNT-AS1的相对表达水平。

1.2.4MTT细胞增殖实验3组细胞在培养箱中培养24h后添加5mg/ml MTT溶液40μl，孵育4h后每孔加入200μl DMSO，摇床上充分震荡。接着培养12、24、48、72h，490nm波长测定吸光度值（OD490值），OD490值越高表示细胞增殖能力越强。实验重复3次，取平均值。

1.2.5细胞克隆形成实验将3组细胞按600个细胞/孔培养7d后，测定克隆形成数。先去除培养液，用PBS清洗3遍，再用甲醇固定细胞20min，然后1%亚甲基蓝染色40min，去离子水清洗2遍，晾干。显微镜下计算＞50个细胞的克隆形成数量。

1.2.6流式细胞术检测细胞凋亡采用Annexin V/PI染色检测，将3组细胞消化成单细胞悬液后，PBS清洗2次，Binding Buffer重悬，加入相应比例的Annexin V抗体，避光染色10min后加入适量PBS溶液以及PI染料，流式细胞仪检测Annexin V阳性细胞比例来确定细胞凋亡情况。

1.2.7Western blot法检测细胞凋亡蛋白Caspase3、8、9表达提取sh-vector组和sh-NNT-AS1组细胞总蛋白，每孔30μg总蛋白上样，常规湿法转膜，5%脱脂奶粉封闭2h；分别加入caspase3、8、9、β-actin一抗（1∶200），孵育过夜，PBS漂洗，再加入二抗1∶1 000，孵育2h，ECL液发光，凝胶成像系统显影。用Quantity One 1-D分析软件（美国Bio-Rad公司）对蛋白质印迹条带进行定量。以目的蛋白测定值与GAPDH的比值作为蛋白的相对表达水平。

1.3观察指标（1）比较胃癌细胞与正常胃成纤维细胞LncRNA NNT-AS1表达水平；（2）比较sh-NNT-AS1组、sh-vector组、对照组细胞增殖情况；（3）比较sh-NNTAS1组、sh-vector组、对照组细胞凋亡情况；（4）比较sh-NNT-AS1组、sh-vector组细胞凋亡蛋白Caspase3、8、9表达水平。

1.4统计学处理应用SPSS20.0统计软件；计量资料以表示，两组比较采用两独立样本t检验，3组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1胃癌细胞与正常胃成纤维细胞LncRNA NNT-AS1表达水平比较见图1。

图1　胃癌细胞与正常胃成纤维细胞LncRNA NNT-AS1表达水平比较（**P＜0.01）

由图1可见，LncRNA NNT-AS1在胃癌细胞系KATO-Ⅲ、NUGC-3、AGS、N87的相对表达水平分别为5.33±0.67、4.82±0.97、3.86±0.54及4.13±0.44，在正常胃成纤维细胞NSFC的相对表达水平为1.0±0.03。胃癌细胞系KATO-Ⅲ、NUGC-3、AGS、N87 LncRNA NNT-AS1的表达水平均明显高于正常胃成纤维细胞系NSFC（均P＜0.01）。

2.2sh-NNT-AS1组、sh-vector组、对照组细胞增殖情况比较见图2。

图2　sh-NNT-AS1组、sh-vector组、对照组细胞增殖情况比较（a:OD490值比较；b：克隆形成数比较；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）

由图2可见，细胞培养12、24、48、72 h后，相比sh-vector组、对照组，sh-NNT-AS1组OD490值明显降低（均P＜0.05）。细胞培养7d后，sh-NNT-AS1组克隆形成数明显低于sh-vector组、对照组（均P＜0.05）。即LncRNA NNT-AS1沉默抑制胃癌细胞增殖。

2.3sh-NNT-AS1组、sh-vector组、对照组细胞凋亡情况比较见图3。

图3　sh-NNT-AS1组、sh-vector组、对照组细胞凋亡情况比较（a：流式细胞图比较；b：凋亡率比较；**P＜0.01）

由图3可见，sh-NNT-AS1组细胞凋亡率明显高于sh-vector组、对照组（均P＜0.01），即LncRNA NNTAS1沉默促进胃癌细胞凋亡。

2.4sh-NNT-AS1组、sh-vector组细胞凋亡蛋白Caspase3、8、9表达水平比较见图4。

由图4可见，sh-NNT-AS1组细胞凋亡蛋白Caspase3、9表达水平均高于sh-vector组（均P＜0.05），而Caspase 8表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。即LncRNA NNT-AS1沉默促进胃癌细胞凋亡的机制是通过上调凋亡蛋白Caspase3、9表达来诱导。

图4　sh-NNT-AS1组、sh-vector组细胞凋亡蛋白Caspase3、8、9表达水平比较（a:蛋白电泳图比较；b：蛋白表达水平比较；*P＜0.05，**P＜0.01）

3　讨论

胃癌的发生、发展是涉及到一系列病因的多步骤、复杂过程。幽门螺杆菌感染、高盐饮食、家族史、吸烟都是影响胃癌发病的因素[8-9]。约95%的胃癌为腺癌，依据大体形态可分为弥散型和肠型。早发现、早手术仍是治疗胃癌的最有效方法，但胃癌在临床发现时往往已是晚期，明确胃癌的发病机制对提高胃癌治疗效果显得尤为重要。

肿瘤的发生、发展涉及一系列重要分子和信号通路突变，如miRNA[10-11]、p53[12]、Ras[13]、LncRNAs[14]等。LncRNAs是近年来肿瘤界研究的热点分子，其被报道在肿瘤发生、发展过程中起重要作用。Tuo等[15]报道LncRNA UCA1通过下调miR-143表达在乳腺癌中起促癌作用。Shi等[16]报道LncRNA GAS5过表达可诱导非小细胞肺癌凋亡和生长阻滞。Ding等[17]报道LncRNA PVT1在肝癌组织中表达上调，且与肝癌复发相关。Li等[18]报道LncRNA HOTAIR通过下调肝癌干细胞的SETD2表达促进肿瘤发生。

LncRNA NNT-AS1是种新发现的LncRNAs分子，包含3个外显子，定位于5号染色体的43573185-43603230区[7]。Wang等[7]报道LncRNA NNT-AS1高表达于结肠癌组织，且是影响结肠癌无瘤生存和总生存率的独立影响因素，抑制其表达可在体外及体内抑制结肠癌细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭，并抑制上皮间质转化过程。本研究在体外实验中发现，LncRNA NNT-AS1在胃癌细胞系中较在正常胃上皮细胞系中高表达，沉默LncRNA NNT-AS1表达可抑制胃癌细胞系KATO-Ⅲ细胞增殖和克隆形成。这表明沉默LncRNA NNT-AS1可在体外抑制胃癌细胞增殖。

细胞凋亡是程序性的细胞死亡，是细胞自杀性的过程，以凋亡小体形成为特征，进而DNA裂解成200bp左右的不等片段。细胞凋亡由一系列信号通路所触发，主要包括两条路径[19]，其一为外源性路径，由TNF受体1、Fas/CD95、DR3和TRAIL-R1等死亡受体介导，配体与受体结合后，进一步激活Caspase 3、8酶活性并诱导凋亡[20]；其二为内源性路径，也即线粒体途径，各种凋亡刺激导致线粒体外膜通透性改变，进一步激活Caspase3、8、9，裂解多聚（ADP-核糖）聚合酶，使DNA修复终止，活化核酸内切酶，并将DNA裂解为180～200bp大小的片段，同时破坏细胞骨架蛋白、细胞外基质蛋白、核蛋白等，使细胞失去正常形态，最终诱导细胞走向凋亡[21-22]。本研究对3组分别行流式细胞术，发现sh-NNT-AS1组细胞凋亡率明显高于对照组、sh-vector组，提示沉默LncRNA NNT-AS1表达可诱导胃癌细胞系KATO-Ⅲ凋亡。进一步对sh-NNT-AS1组、sh-vector组行Western blot，发现sh-NNT-AS1组凋亡蛋白Caspase 8表达水平与sh-vector组比较差异无统计学意义，而sh-NNT-AS1组Caspase3、9表达水平均高于sh-vector组，这表明其诱导凋亡的机制是通过内源性通路诱导。

综上所述，本研究结果显示LncRNA NNT-AS1在胃癌细胞中高表达，沉默NNT-AS1表达可抑制胃癌细胞系KATO-Ⅲ增殖，并诱导胃癌细胞系KATO-Ⅲ凋亡，机制可能与上调凋亡蛋白Caspase3、9表达有关。LncRNA NNT-AS1或可作为胃癌治疗的一个新靶点。当然，本研究也存在一些不足，如尚缺乏动物体内的研究数据，LncRNA NNT-AS1靶向调节miRNA分子机制也不清楚，均值得进一步深入研究。

[1]Torre LA,Bray F,Siegel RL,et al．Global cancer statistics,2012[J]．CA：a cancer journal for clinicians,2015,65(2)：87-108．

[2]Chen W,Zheng R,Zuo T,et al．National cancer incidence and mortality in China,2012[J]．Chinese Journal of Cancer Research,2016,28(1)：1．

[3]Matsuda T,Saika K．The 5-year relative survival rate of stomach cancer in the USA,Europe and Japan[J]．Japanese journal of clinical oncology,2013,43(11)：1157-1158．

[4]Kapranov P,Cheng J,Dike S,et al．RNA maps reveal new RNA classes and a possible function for pervasive transcription[J]．Science,2007,316(5830)：1484-1488．

[5]Kogo R,Shimamura T,Mimori K,et al．Long noncoding RNA HOTAIR regulates polycomb-dependent chromatin modification and is associated with poor prognosis in colorectal cancers[J]．Cancer Research,2011,71(20)：6320-6326．

[6]Zhao J,Sun BK,Erwin JA,et al．Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome[J]．Science,2008,322(5902)：750-756．

[7]Wang Q,Yang L,Hu X,et al．Upregulated NNT-AS1,a long noncoding RNA,contributes to proliferation and migration of colorectal cancer cells in vitro and in vivo[J]．Oncotarget,2017,8(2)：3441．

[8]Helicobacter A．Helicobacter and Cancer Collaborative Group．Gastric cancer and Helicobacter pylori：A combined analysis of 12 case control studies nested within prospective cohorts[J]．Gut,2001,49(3)：347-353．

[9]Piazuelo MB,Correa P．Gastric cancer：overview[J]．Colombia Medica,2013,44(3)：192-201．

[10]吴春蓉,罗治彬,陈伟．miR-451对结肠癌细胞系SW620生物学行为的影响[J]．解放军医学杂志,2011,36(5)：478-482．

[11]张超,姚志勇,朱鸣阳,等．MicroRNA-34a通过Notch1对膀胱肿瘤细胞株T24增殖的影响[J]．解放军医学杂志,2012,37(5)：426-430．

[12]周洁,李华仁,张锦波,等．p53,rasp21及C-myc癌基因蛋白在胃癌中的表达及分布特征[J]．解放军医学杂志,2005,30(11)：1009-1011．

[13]李陈婕,羊志辉,陈森林,等．HER-2与K-RAS在结直肠癌中的表达及意义[J]．解放军医学杂志,2007,32(6)：598-600．

[14]石永国,王科明．lncRNA在消化系统肿瘤中的研究进展[J]．中国肿瘤临床,2013(15)：938-940．

[15]Tuo YL,Li XM,Luo J．Long noncoding RNA UCA1 modulates breast cancer cell growth and apoptosis through decreasing tumor suppressive miR-143[J]．European Review for Medical&Pharmacological Sciences,2015,19(18)：3403．

[16]Shi X,Sun M,Liu H,et al．A critical role for the long non-coding RNA GAS5 in proliferation and apoptosis in non-small-cell lung cancer[J]．Molecular Carcinogenesis,2015,54(S1)：E1．

[17]Ding C,Yang Z,Lv Z,et al．Long non-coding RNA PVT1 is associated with tumor progression and predicts recurrence in hepatocellular carcinoma patients[J]．Oncology Letters,2015,9(2)：955．

[18]Li H,An J,Wu M,et al．LncRNA HOTAIR promotes human liver cancer stem cell malignant growth through downregulation of SETD2[J]．Oncotarget,2015,6(29)：27847-27864．

[19]An Q,Han C,Zhou Y,et al．Matrine induces cell cycle arrest and apoptosis with recovery of the expression of miR-126 in the A549 non-small cell lung cancer cell line[J]．Molecular Medicine Reports,2016,14(5)：4042-4048．

[20]Wang L,Yang JK,Kabaleeswaran V,et al．The Fas-FADD death domain complex structure reveals the basis of DISC assembly and disease mutations[J]．Nat Struct Mol Biol,2010,17(11)：1324-1329．

[21]Tait SWG,Green DR．Mitochondrial regulation of cell death[J]．Csh Perspect Biol,2013,5(9)：8706．

[22]McIlwain DR,Berger T,Mak TW．Caspase functions in cell death and disease[J]．Csh Perspect Biol,2013,5(4)：a008656．