米曲霉基因工程技术的进展

张智敏 庄淼 金锋杰

（南京林业大学 江苏省南方现代林业协同创新中心，南京 210037）

米曲霉因其特有的生理生化性质以及安全无毒性，被美国食品药品管理局（Food and drug adiministration，FDA）及世界卫生组织列为食品级安 全 菌 株（Generally recognizedas safe，GRAS）［1］，被广泛用于食品、饲料、曲酸生产、酿酒等发酵工业和食品加工业。2005年，随着米曲霉全基因组序列被破译，标志着米曲霉全基因组时代的来临，结合基因工程技术进一步推动了米曲霉的发展。与同源性较近的构巢曲霉和烟曲霉相比，米曲霉基因组要大7-9 Mb［2］，并且比酿酒酵母的基因组大25 Mb［3］。我们发现米曲霉相对于植物和哺乳动物具有较强的蛋白质分泌、合成能力以及快速生长，易培养等优点，与大肠杆菌和酵母相比也具有强大的翻译后修饰功能［4］，因此被广泛应用于细胞工厂生产多种酶制剂。另外米曲霉还可以用于生产次生代谢产物，如青霉素、曲酸等。当然在米曲霉外源表达过程中依然存在着一些不足，如mRNA的不稳定性［5］，错误折叠的外源蛋白被自身蛋白酶分解导致外源蛋白产量降低［6］。全基因组的破译与随之不断发展的基因工程技术的有效结合为克服这些不足提供了可能，基于表达序列标签（Expressed sequence tag，EST）的基因组学研究和DNA微矩阵技术的应用为深入研究米曲霉外源表达系统提供了条件［7］，推动了米曲霉外源蛋白表达系统的研究。这些不断发展的基因工程新技术共同为今后米曲霉的研究铺展了新的途径，并为其工业应用奠定了理论基础。

1 米曲霉转化系统的基础研究

在工业应用中，建立高效的遗传转化系统是应用米曲霉表达外源蛋白的前提。相对于酵母和大肠杆菌，米曲霉存在着坚韧的细胞壁，这对于后期转化有一定的阻碍，因此常规的转化方法不仅成本高，且效率低下，如电击法、基因枪法。为了提高转化率以及降低成本，目前普遍采用的是PEG/CaCl2介导的原生质体转化方法［8］。

1.1 选择性标记基因的应用

常见的营养缺陷标记基因，如pyrG、niaD、sC、adeA/adeB和argB等；致突型或建立特殊代谢途径的标记基因，如amdS、ptrA等。其中最早开发建立也是目前应用最广泛的是Mattern［9］开发的基于乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因（pyrG）的米曲霉转化体系和Kitamoto［10］硝酸盐还原酶营养缺陷型（niaD）转化系统。之后通过UV变异以及基因敲除等技术构建了含有多个筛选标记基因缺陷株的米曲霉多重转化系统，可以在同一菌株中进行多个基因的导入或删除等基因工程操作［11-12］，为以后米曲霉的生产应用研究奠定了基础。

1.2 染色体加工技术的开发及应用

在以往的对米曲霉的基础研究当中，导致米曲霉基础研究滞后的一个最主要原因是基因敲除技术，即同源重组转化效率的低下。Takahashi等［13］通过敲除非同源末端连接（Nonhomologous end-joining，NHEJ）相关基因ku70、ku80和ligD等基因，大幅度提高了米曲霉的同源重组效率，从而提高了米曲霉的基因敲除效率。随着同源重组效率的大幅度提高，Takahashi等还开发了染色体大片段删除技术［14-15］，为后面大片段删除染色体上不必要甚至有害片段提供了技术支持。由于米曲霉中依然存在着类似黄曲霉的毒素合成相关基因簇，尽管正常情况下是不表达的，但是也存在着一定的风险，通过大片段染色体的删除技术可以将这些基因簇全部删除。Jin等［16］在此基础上对米曲霉第7条染色体进行了基因组缩短实验，并成功地去除了大部分非必需的冗长片段以及毒素合成相关基因簇，不仅促进了淀粉酶的生产并且避免了一些对人体有害的副产物产生。以上这些技术的开发为今后米曲霉的生产利用开辟了一条新的途径。

除此之外，米曲霉并没有有性生殖，因此在生产应用方面具有一定的局限性。例如，不能通过有性杂交获得更优良的生产菌株。Hara等［17］将第8条染色体缩短菌株与第7条染色体缩短菌株分别原生质体化并进行融合，获得了两条染色体同时缩短的融合体菌株。通过大片段染色体删除技术结合原生质体融合技术，很有效的解决了这一困扰米曲霉研究者多年的问题，并为今后更好的进行染色体加工获得优良菌株的选育提供了很好的技术手段。另外，利用大片段染色体删除技术，Jin等［18］还发现了一个碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix，BHLH）家族转录因子SclR，研究表明SclR不仅能通过促进菌丝融合从而促进菌核的形成，同时还能有效促进细胞核之间的融合能力，为今后通过细胞核融合技术选育优良菌种提供了更大的可行性空间［19］。以上研究表明，染色体大片段删除技术对于发现和探索功能基因的研究也具有重要价值。

2 米曲霉外源表达系统的研究

作为工业生产菌株以及近年来作为细胞工厂的广泛应用，米曲霉外源蛋白表达的研究也越来越受人们的重视，如何优化外源表达系统对于米曲霉在工业上的应用意义深远。通过分析米曲霉外源表达的优缺点，结合近年来不断发展的基因工程技术，“扬长避短”共同提高米曲霉的外源表达。

2.1 降低米曲霉自身蛋白酶活性

与原核生物如大肠杆菌的生产/分泌系统相比，在米曲霉中表达的外源蛋白经历真核翻译后修饰，包括糖基化和蛋白质折叠等。由于这些原因，米曲霉被认为是表达高等真核生物蛋白的最突出的宿主之一［20］。外源蛋白生产很多限制因素，如转录水平、翻译水平、分泌过程和细胞外降解等［21］。但是目前来说米曲霉自身的蛋白酶是抑制表达外源蛋白的最主要问题，因为外源蛋白相对同源蛋白更容易被蛋白酶分解。为了增加外源蛋白的产量，研究人员尝试了各种生物学方法。例如，在低温下进行下游处理、较早的将产物与蛋白酶分离、运用蛋白酶抑制剂等，这样处理虽然可以减少水解作用，但是从效果来看并不乐观，因为许多外源蛋白在蛋白产生的过程中就会发生降解［22］。Jin等［23］通过UV定向变异和选择标记性基因敲除技术，获得了具有腺嘌呤（Adenine）和精氨酸（Arginine）营养缺陷型的新性状，最终构建多重营养缺陷型菌株，并通过构建酸性蛋白酶PepE和三肽酶TppA双基因敲除菌株来表达外源人溶菌酶（Human lysozyme，HLY）基因，使酶产量提高20倍以上。Yoon等［24］在此基础上连续敲除5个蛋白酶基因（tppA、pepE、nptB、dppIV和dppV），同时破坏5个蛋白酶基因显示出外源蛋白牛凝乳酶（CHY）的产量比此前的双基因敲除（tppA、pepE）提高了34%。Yoon等［11］又进一步利用选择标记性基因pyrG可以反复循环使用的特点敲除了另外5个蛋白酶基因（alpA、pepA、AopepAa、AopepAd和cpI），结果显示人溶菌酶和牛凝乳酶蛋白产量分别是参照株的3.2倍和3.8倍。为了更精准的探究影响外源蛋白分泌的蛋白酶基因，Yoon等［25］破坏编码液泡蛋白分选受体的Aovps10基因，结果显示CHY和HLY的最大细胞外生产水平分别提高了3倍和2.2倍，说明Aovps10在外源蛋白降解中起重要作用。之前研究蛋白酶基因（tppA，pepE）的双重敲除菌株改善了人类溶菌酶（HLY）的生产，但是溶菌酶表达质粒由于其整合到基因组中而不能被去除，因此Nemoto等［26］重新构建了tppA，pepE破坏菌株作为外源蛋白质生产的宿主，通过UV变异分离出了HLY-超生产突变体。随后，从突变体中除去含有溶菌酶基因的导入质粒，将得到的菌株命名为AUT菌株。Nemoto等利用AUT菌株进行外源蛋白生产，结果显示HLY和CHY的产量分别比参照菌株高2.6-3.2倍。Yaver 等［27］研究发现当palB基因被破坏后，米曲霉的脂肪酶表达量增加。Zhu等［28］破坏三肽基肽酶基因AosedD成功获得了转化菌株，转化菌株的CHY和HLY的最大产量分别比参照菌落提升了约2.9倍和1.7倍，这表明AoSedD在外源蛋白降解中起重要作用。紧接着Zhu 等［29］在原本高表达AUT1菌株中再敲除掉两个Aovps10和AosedD，结果表明CHY和HLY的生产水平相对于AUT1菌株分别提高了1.6倍和2.1倍。

2.2 分泌外源蛋白路径的优化

丝状真菌分泌生产外源蛋白质常会受限于一些瓶颈问题：包括转录、翻译、蛋白质折叠、易位、运输和分泌等，外源蛋白的大量表达将导致内质网（Endoplasmic reticulum，ER）超负荷、蛋白折叠能力的下降以及激活未折叠蛋白质反应（Unfolded protein response，UPR）［30］。ER 折叠酶和分子伴侣（Molecular chaperones）相关基因的过表达可以部分缓解ER超负荷。例如，BipA和蛋白质二硫键异构酶（Protein disulfide isomerase，PDI）的基因过表达可以有效帮助提高外源蛋白生产［31-32］。而液泡蛋白质分选（Vacuolar protein sorting）、自体吞噬（autophagy）、内质网-高尔基体货物受体（Endoplasmic reticulum-Golgi cargo receptors）相关基因也影响着米曲霉外源蛋白的生产［33-34］。

2.3 融合目标蛋白到内源性分泌酶载体蛋白

为了提高外源蛋白的表达量除了降低自身蛋白酶的活性，还可以将外源蛋白基因与自身高分泌蛋白基因融合表达［35］。目前研究表明将外源蛋白基因融合到米曲霉自身高分泌内生蛋白基因的末端，能有效的降低外源蛋白被米曲霉自身蛋白酶分解［36］。Ohno 等［37］通过比较CHY与自身淀粉酶基因融合和非融合基因的两种米曲霉菌株，得出结论当将CHY与淀粉酶（AmyB）基因融合表达时，生产水平增加约2倍。Tsuchiya 将［38］小牛前凝乳酶 cDNA 片段与米曲霉葡萄糖淀粉酶基因（glaA）部分片段融合重组表达小牛凝乳酶，在浸没培养中重组表达的凝乳酶是凝乳酶基因直接连到 glaA 启动子下游表达量的5倍。

2.4 其他生物技术研究方法的应用

紫外线照射等引起的随机突变是一种比较传统有效提高丝状真菌外源蛋白生产能力的方法。如前所述，使用HLY作为筛选指标，分离了米曲霉超生产突变株（AUT1-8）。我们进一步利用二代测序技术和比较基因组学，第一次在米曲霉变异菌株中成功确定了蛋白生产相关的变异位点［39］。诱变处理通常分两个途径：化学物理诱变和基因调控诱变。诱变处理是目前常用的研究方法，具有操作简单成本低等特点，但是具有不可操控性。米曲霉全基因组的破译和生物技术的发展，为人为通过基因调控米曲霉功能奠定了基础。

Ham等［40］通过y射线的处理野生型米曲霉获得四代稳定曲酸KA最高产量突变体，在麦芽提取物蔗糖培养基（MES）中，KA产量分别是其野生型菌株的2.03倍和1.9倍。人为敲除和反义RNA，可以达到基因调控诱变的目的。反义rRNA可以与mRNA分子特异结合，使mRNA分子沉默，从而抑制该rRNA的加工与翻译。敲除一些功能基因能改变米曲霉某一功能以及部分表型，如提高部分酶的产量、菌核、菌丝的形态变化、色素的改变等［41］。Murthy等［42］利用UV处理米曲霉得到一个高产酸性蛋白酶的菌株，产量为亲菌的5.6倍。Wang等［43］利用基因重组等技术获得突变体菌株RIII-7，高果糖基转移酶（FTase）活性180 U g-1是原始菌株的2倍，在发酵培养中，达到最大值353 U/g。

一直认为米曲霉没有活性化转座子（Transposon），近年发现其不仅有活性化转座子（Tc1/marinertype transposable element）和反转录转座子（LTR-retrotransposable element）的存在，而且在适当的条件下在米曲霉中可以产生多拷贝现象［44-45］。这一现象的发现有望今后在米曲霉中构建多拷贝外源蛋白生产菌株从而提高外源蛋白生产能力。

3 米曲霉次生代谢产物的分析

作为发酵生产菌株，米曲霉不仅能生产大量淀粉酶和蛋白酶，同时还能生产大量有用的次级代谢产物，但是这方面的研究进展相对缓慢。随着近年大量曲霉菌基因组测序的展开，通过比较基因组学，可以预测一些物质的生产，而其中只有很少的一部分代谢产物的相关基因簇被掌握［46-47］。例如，通过基因组比较发现，在米曲霉中保留有生产青霉素的基因簇，而且保持非常高度的完整性，但产量极低。通过人为调控基因的高效表达，使青霉素的产量提高了100倍［48］。除了青霉素以外，米曲霉还生产曲酸等有用次级代谢产物［49］。综上所述，尽管近年对曲霉菌次级代谢产物的研究已经取得了一定的进展［50-51］，但是还有很多未知领域等待进一步的发现。

4 问题及展望

米曲霉全基因组序列的破译，为深刻理解米曲霉的遗传背景和生产性能，快速挖掘其作为工业生产菌株的潜能，提供了丰富、可靠的遗传信息，大力推动了米曲霉的相关研究。而随后的米曲霉基因工程新技术的建立和快速发展，更是为其生产菌株的育种和工业生产利用开辟了更多可能的途径。近年来的研究虽然一定程度上提高了米曲霉的外源蛋白酶制剂等有用物质的生产能力，但与预期还相差甚远。

目前，除了上述外源蛋白表达中存在的瓶颈问题，还有以下一些问题需要进一步克服，如（1）酶提取过程中如何保证较高的活性；（2）部分强启动子的导入，如cbh1启动子会被葡萄糖和其它的容易利用的碳源抑制；（3）目前在工业生产中，大分子物质如麦麸、米糠、青贮饲料、玉米及豆粕等难以被米曲霉所利用，因此利用生物技术进行改良使其能降解吸收大分子物质，从而降低生产成本并减少原材料废弃物带来的污染；（4）大量产生的外源蛋白对于米曲霉本身会产生一定的不良影响；（5）在米曲霉生长后期存在反抑制调控，高浓度产物会抑制米曲霉的发酵生产。虽然Ichinose等［52］通过删除单creA和双creA / creB基因片段，在一定程度上提高了在高浓度诱导糖培养后期的淀粉酶活性，但效果并不明显。

另外，尽管全基因组序列已经被破译，但米曲霉大多数基因功能尚不明确，对其生产利用仍存在诸多限制。因此今后仍有很多未知功能基因和领域需要进一步的发现和探索。而近年逐步发展起来的组学新技术，如比较蛋白质组学及代谢组学等为今后功能基因的研究和蛋白分泌途径的探索开创了全局性思维和新视野。综上，如何将基因工程技术和米曲霉的生产应用完美结合，获得高效生产菌株的育种，依然存在很大的空间有待今后更深入的研究和探索。