人脑胶质瘤组织中HMGB1、TLR4的表达

杨如意,赵普学,许自强,安　全,李俊武,王新军

1)郑州大学第五附属医院伽玛刀治疗中心；河南省伽玛刀治疗中心 郑州 450052　2)郑州大学第五附属医院神经外科 郑州 450052

胶质瘤是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤，占中枢神经系统肿瘤的40%～50%。世界卫生组织将胶质瘤分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级，其对胶质瘤的临床治疗及预后意义重大，而胶质瘤的发病机制目前尚未完全明确。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1，HMGB1)是最早由Ellerman等[1]从小牛胸腺中分离得到的一种染色质非组蛋白核蛋白，几乎存在于所有真核细胞内。研究表明，HMGB1高表达与多种疾病密切相关，如哮喘患者气道炎症[2]、胃癌[3]、系统性红斑狼疮性疹[4]、癫痫[5]；另有研究表明，HMGB1与膀胱癌[6]、肝癌[7]患者预后密切相关。以往较少见到HMGB1及其受体Toll样受体4(Toll like receptor-4, TLR4)与胶质瘤发病机制、肿瘤病理等方面的研究，本研究致力于探讨胶质瘤患者肿瘤组织中HMGB1及其受体TLR4的表达水平与患者肿瘤病理、临床各因素的相关性，进一步揭示HMGB1-TLR4通路在胶质瘤发病、病理中的作用。

1　对象与方法

1.1研究对象选取2015年1月1日至2017年1月1日于郑州大学第五附属医院神经外科行“胶质瘤切除术”的胶质瘤患者87例为试验组，其中男44例，女43例；中位年龄44(22～76)岁，其中≤44岁43例，>44岁44例；胶质瘤位于额叶43例，颞叶25例，枕叶19例；病理类型为星形胶质细胞瘤35例，少突星形细胞瘤30例，胶质母细胞瘤22例；低级别胶质瘤(low grade glioma,LGG)40例，高级别胶质瘤(high grade glioma，HGG)47例。纳入标准：①患者术前头颅增强MRI及MRS提示胶质瘤，术后病理确诊为胶质瘤。②所有患者均为首次手术治疗，无胶质瘤复发二次手术患者。③患者术前未行放化疗。选取同期于该院行“颅内减压术”患者20例为对照组，其中男12例，女8例；中位年龄41(17～65)岁。纳入标准：①患者为高血压脑出血需行“颅内减压术”。②术中确认可留取非功能区正常脑组织。研究中获取组织标本及临床信息前均已获患者、家属知情同意。

1.2标本采集试验组：术中切除烂鱼肉样肿瘤组织后，取足够病理检测标本前提下，取直径约1 cm的脑组织标本块3份。对照组：术中留取直径约1 cm的非功能区正常脑组织标本块3份。所有标本保存于冻存管内液氮冻存，转移至-80 ℃冰箱中保存，以备检测。

1.3肿瘤组织中HMGB1及TLR4的免疫组化检测标本包埋完毕以3 μm厚切片，切片置于防脱剂预处理后的载玻片上。分别滴加HMGB1、TLR4单克隆抗体于4 ℃环境下过夜，PBS清洗后滴加标记二抗羊抗兔IgG，室温下孵育20 min。PBS清洗后加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，室温下孵育15 min。DAB显色剂显色并冲洗，苏木精复染后常规乙醇脱水，二甲苯透明后中性树胶封片于显微镜下观察。PBS液代替一抗染色作为阴性对照。HMGB1及TLR4的表达依据细胞质免疫组化染色率及染色程度综合评分[6-7]。选择每张切片免疫反应较强的区域，200倍视野下观察5个不重复视野，分别计数HMGB1、TLR4染色细胞及视野内总细胞数，染色率=(染色细胞数/总细胞数)×100%。无染色细胞为0分，染色率<25%为1分，25%～为2分，50%～为3分，75～%为4分；染色程度依据细胞质染色深度进行评分：无染色为0分，淡褐色为1分，深褐色为2分。取2种评分之和为最终得分：0分，阴性(-)；1～6分，阳性，其中1～3分为低表达(+)，4～6分为高表达()。

1.4肿瘤组织中HMGB1及TLR4的Westernblot检测取冰冻组织300 mg，剪碎并置于匀浆器中进行蛋白裂解，冰上匀浆，充分裂解组织标本中HMGB1和TLR4，严格按试剂盒操作步骤进行检测，采用凝胶成像分析系统测定各条带的吸光度值，以此代表相对表达量。实验重复3次。

1.5统计学处理采用SPSS 21.0进行统计学处理。试验组与对照组脑组织中HMGB1、TLR4阳性表达率的比较采用校正χ2检验或Fisher确切概率法；试验组患者胶质瘤组织中HMGB1、TLR4表达水平与临床因素的关系采用χ2检验进行分析；利用列联系数分析试验组胶质瘤组织中HMGB1与TLR4表达的关联性；采用两独立样本的t检验分析不同病理级别肿瘤组织中HMGB1、TLR4表达水平的差异。检验水准α=0.05。

2　结果

2.12组脑组织中HMGB1、TLR4表达的比较试验组患者胶质瘤组织中HMGB1、TLR4阳性表达率均高于对照组(表1、图1)。

表1　2组脑组织中HMGB1、TLR4表达情况的比较　例

*：确切概率法;#:校正χ2检验

A：HMGB1阴性表达；B：HGMB1低表达；C：HGMB1高表达；D：TLR4阴性表达；E：TLR4低表达；F：TLR4高表达图1　脑组织中HMGB1、TLR4免疫组化染色结果(SP，×200)

2.2试验组肿瘤组织中HMGB1、TLR4表达水平与临床因素的关系试验组患者胶质瘤组织中HMGB1及其受体TLR4表达水平与胶质瘤病理级别有关，而与患者性别、年龄、胶质瘤位置、胶质瘤病理类型无关(表2)。

表2　试验组患者胶质瘤组织中HMGB1、TLR4表达水平与临床因素的关系　例

2.3试验组胶质瘤组织中HMGB1与TLR4表达水平的关联性试验组患者胶质瘤组织中HMGB1表达水平与TLR4表达水平呈正相关(表3)。

2.4试验组不同病理级别肿瘤组织中HMGB1、TLR4的Westernblot检测结果比较结果见图2、表4。HMGB1及其受体TLR4在HGG组织中表达水平均较LGG组织高。

表3　试验组胶质瘤组织中HMGB1与TLR4表达水平的关联性分析　例

χ2=29.964,rp=0.515,P<0.001

图2　不同病理级别胶质瘤组织中HMGB1、TLR4的表达

表4　不同病理级别胶质瘤组织中HMGB1、TLR4表达水平的比较

3　讨论

HMGB1作为一种染色体结合蛋白，在机体内既可充当染色体的结构蛋白，又可作为一种细胞因子。研究[8-10]表明，HMGB1可在肿瘤细胞的细胞核中高表达，同时也可通过炎症反应被释放至细胞外。肿瘤在缺氧、营养缺乏或生长必需营养因子缺乏而坏死时，或者在抗肿瘤药物所致的肿瘤细胞坏死时均有HMGB1被释放至细胞外的情况。

HMGB1可与多种因子，如P53[11]、P73[12]以及NF-κB家族因子[13]、雌激素受体[14]共同作用促进肿瘤细胞的复制与肿瘤的发展。细胞外的HMGB1可与其受体TLR4或RAGE结合，激活细胞外重要的细胞通路，如MAPK、NF-κB[15-16]通路，以诱发肿瘤细胞的生长、侵袭、转移。研究[17]表明，通过抑制HMGB1受体RAGE的表达可明显抑制结直肠癌的复发。HMGB1通过TLR家族受体参与免疫反应，TLR家族受体几乎存在于所有的免疫抑制细胞内。研究[18]表明肿瘤细胞产生的HMGB1可促进T细胞产生IL-10，从而抑制机体免疫功能。这些发现均表明，HMGB1及其受体在肿瘤的免疫抑制中发挥了重要作用，促使肿瘤的侵袭和转移。

HMGB1及其受体TLR4、RAGE在各系统肿瘤中的研究均有报道，目前尚鲜见神经系统肿瘤如胶质瘤的发病、病理、治疗、预后与HMGB1及其受体关系的研究。本研究通过检测HMGB1及其受体TLR4在胶质瘤患者肿瘤组织中的表达，分析其与患者临床病理因素的关系，探讨其临床意义。胶质瘤患者肿瘤组织中HMGB1、TLR4的表达均与患者性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤病理类型无关，而与患者的病理级别密切相关。胶质瘤患者预后与胶质瘤病理级别关系密切已为神经外科医师公认。胶质瘤患者肿瘤组织中HMGB1、TLR4均与患者病理级别密切相关，表明HMGB1及其受体TLR4可能直接参与胶质瘤的发病，其发病机制是否与HMGB1-TLRs参与肿瘤免疫反应有关，尚需进一步研究阐明。此外，本研究结果还显示，胶质瘤组织中HMGB1与其受体TLR4的表达水平呈正相关，进一步表明HMGB1-TLR4形成通路在胶质瘤的发病中发挥重要作用。

目前的研究为胶质瘤病理级别与胶质瘤组织中HMGB1-TLR4的相关性研究，仍需大量研究以阐明HMGB1-TLR4通路在胶质瘤发病中的机制，后期将着力于HMGB1-TLR4与胶质瘤患者预后之间的研究，并发掘HMGB1-TLR4通路的临床应用价值。

[1] ELLERMAN JE,BROWN CK,DE VERA M,et al.Masquerader:high mobility group box-l and cancer[J].Clin Canc Res,2007,13(10):2836

[2] 乔俊英,张艳丽,宋丽,等.高迁移率族蛋白B1和Toll样受体4与哮喘气道炎症的关系及维生素D的作用[J].西安交通大学学报(医学版),2017,38(4):529

[3] AKAIKE H,KONO K,SUGAI H,et al.Expression of high mobility group box chromosomal protein-1 (HMGB-1) in gastric cancer[J].Anticancer Res,2007,27(1A):449

[4] PISETSKY DS.The complex role of DNA, histones and HMGB1 in the pathogenesis of SLE[J].Autoimmunity,2014,47(8):487

[5] 王怀立,郭庆敏,禚志红,等.癫痫患儿血清高迁移率族蛋白1及白细胞介素-6水平变化的意义[J].中华实用儿科临床杂志,2015,30(22):1738

[6] YANG GL,ZHANG LH,BO JJ,et al.Increased expression of HMGB1 is associated with poor prognosis in human bladder cancer[J].J Surg Oncol,2012,106(1):57

[7] LIU F,ZHANG Y,PENG Z,et al.High expression of high mobility group box 1 (hmgb1) predicts poor prognosis for hepatocellular carcinoma after curative hepatectomy[J].J Transl Med,2012,10(12):135

[8] DONG XD,ITO N,LOTZE MT,et al.High mobility group box 1(HMGB1)release from tumor cells after treatment:implications for development of targeted chemoimmunotherapy[J].J Immunother,2007,30(6):596

[9] KUNIYASU H,OUE N,WAKIKAWA A,et al.Expression of receptors for advanced glycation end-products (RAGE) is closely associated with the invasive and metastatic activity of gastric cancer[J].J Pathol,2002,196(2):163

[10]KEPP O,TESNIERE A,SCHLEMMER F,et al.Immunogenic cell death modalities and their impact on cancer treatment[J].Apoptosis,2009,14(4):364

[11]LIVESEY KM,TANG D,ZEH HJ,et al.Not just nuclear proteins:novel autophagy cancer treatment targets,p53 and HMGB1[J].Curr Opin Investig Drugs,2008,9(12):1259

[12]URAMOTO H,IZUMI H,NAGATANI G,et al.Physical interaction of tumour suppressor p53/p73 with CCAAT-binding transcription factor 2(CTF2)and differential regulation of human high mobility group 1(HMG1)gene expression[J].Biochem J,2003,371(Pt 2):301

[13]AGRESTI A,LUPO R,BIANCHI ME,et al.HMGB1 interacts differentially with members of the Rel family of transcription factors[J].Biochem Biophys Res Commun,2003,302(2):421

[14]EL MARZOUK S,GAHATTAMANENI R,JOSHI SR,et al.The plasticity of estrogen receptor-DNA complexes:binding affinity and specificity of estrogen receptors to estrogen response element half-sites separated by variant spacers[J].J Steroid Biochem Mol Biol,2008,110(1/2):186

[15]GHAVAMI S,RASHEDI I,DATTILO BM,et al.S100A8/A9 at low concentration promotes tumor cell growth via RAGE ligation and MAP kinase-dependent pathway[J].J Leukoc Biol,2008,83(6):1484

[16]PALUMBO R,GALVEZ BG,PUSTERLA T,et al.Cells migrating to sites of tissue damage in response to the danger signal HMGB1 require NF-kappaB activation[J].J Cell Biol,2007,179(1):33

[17]LIANG HS,ZHONG YH,ZHOU SB,et al.Knockdown of RAGE expression inhibits colorectal cancer cell invasion and suppresses angiogenesisinvitroandinvivo[J].Cancer Lett,2011,313(1):91

[18]LIU Z,FALO LD JR,YOU Z.Knockdown of HMGB1 in tumor cells attenuates their ability to induce regulatory T cells and uncovers naturally acquired CD8 T cell-dependent antitumor immunity[J].J Immunol,2011,187(1):118