大豆分离蛋白对大鼠阿霉素肾病模型稳定性的影响

朱建立，何美霞，汲振余，张　勇，郭　佳，盛誉妍，郭建成，权松霞，杜　斌

1)郑州大学医药科学研究院 郑州 450052　2)郑州大学第一附属医院肾内科 郑州 450052　3)郑州大学药学院 郑州 450052

阿霉素(adriamycin,ADR)肾病动物模型是当今肾病科研领域应用较多的经典模型[1]，该模型的建立与ADR的剂量，给药途径、次数、间隔时间，单侧肾切除或一侧肾动脉钳夹等因素密切相关[2]。本研究中我们通过在大鼠饲料中添加大豆分离蛋白，复制出成功率高、一致性好、简便易行的ADR肾病动物模型，并对该模型进行了长期动态观察，现报道如下。

1　材料与方法

1.1实验动物SPF级雄性SD大鼠，体重130～150 g，购于河南省动物实验中心，动物许可证号：SCXK(豫)2005-0001。动物实验操作在郑州大学医药科学研究院动物实验中心SPF级实验室完成。室温22～26 ℃，湿度50%～70%，光照正常，昼夜交替。

1.2实验方法大鼠适应性喂养1周后，进行尿常规检测。将检测结果正常的70只大鼠随机分为对照组(n=7)、普通饲料组(n=31)和高蛋白饲料组(n=32)。用生理盐水将ADR (浙江海正药业股份有限公司，批号100501)配制为0.2 g/mL的溶液，参考文献[3]，普通饲料组和高蛋白饲料组第1次按4.0 mg/kg的用量由尾静脉注射ADR，1周后按3.5 mg/kg的用量再次注射ADR；对照组注射等量的生理盐水；高蛋白饲料组大鼠从第1次注射ADR起，给予2周高蛋白饲料喂养，此后改为普通饲料喂养；普通饲料组和对照组大鼠始终采用大鼠全价颗粒饲料和无菌水喂养。全价颗粒饲料经河南省农科院质标中心检验粗蛋白含量为24.87%，高蛋白饲料是在全价颗粒饲料中加入占比为20%的大豆分离蛋白(湖北省云梦龙云蛋白食品有限公司，批号：20120321-5)，粗蛋白含量32.68%。

1.3观察指标①记录3组大鼠造模18 d后的存活率。②24 h尿蛋白总量(24 h Pro)：从首次注射ADR起至第18天每天收集24 h 尿液，测定尿液体积，采用磺基水杨酸-硫酸钠法测定24 h Pro， 24 h Pro>30 mg者计入ADR肾病模型；并于造模前，造模24、31、38、45和52 d，同法测定对照组和高蛋白饲料组大鼠的24 h Pro，进行动态观察。③后肢足掌厚度：造模24、31、38、45和52 d，测量对照组和高蛋白饲料组大鼠左后肢足掌的厚度(mm)，减去造模前的数值，计算厚度变化的百分数，作为水肿程度变化的标志。④血清白蛋白和肾功能水平：造模前，造模24、31、38、45和52 d，对照组和高蛋白饲料组大鼠眶后静脉丛取血，检测血清白蛋白和血清尿素氮水平。⑤肾脏组织形态学观察：造模24 d后，随机抽取对照组和高蛋白饲料组大鼠各1只，处死，取肾脏，切片厚度为3 μm。进行碘酸雪夫染色(PAS)，PAS试剂盒由福州迈新生物技术开发有限公司提供。光镜下观察肾小球组织结构。用透射电镜(TEM)观察肾小球足突结构和基底膜。实验结束时(造模52 d)，取2组动物双侧肾脏，分离包膜后称重，计算脏器系数(双侧肾脏重量/体重×100%)。

1.4统计学处理动物造模18 d，3组大鼠24 h Pro水平的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；不同时间点小鼠24 h pro、水肿程度、血清白蛋白和尿素氮的变化采用重复测量数据的方差分析；实验结束，对照组和高蛋白饲料组脏器系数的比较采用两独立样本t检验，检验水准α=0.05。

2　结果

2.1造模18d后3组大鼠的存活率和24hpro比较对照组和高蛋白饲料组大鼠的存活率均为100%；普通饲料组大鼠自注射ADR后第12天死亡4只，第13天死亡4只，第14天死亡3只，第15天死亡1只，第16天死亡4只，至第18天时累计死亡16只，存活率为50%，说明给予ADR建模饲喂普通饲料大鼠死亡率高，以下着重观察建模后给予高蛋白饲料的大鼠与正常对照各指标的差异。动物造模18 d，对照组、普通饲料组和高蛋白饲料组大鼠24 h Pro分别为(7.1±1.4)、(115.6±84.0)和(33.5±3.6) mg，3组相比，差异有统计学意义(F=8.139，P=0.004)；与对照组相比，普通饲料组和高蛋白饲料组大鼠24 h Pro均升高(P均<0.05)；同时普通饲料组高于高蛋白饲料组(P<0.01)，且前者24 h Pro所测得数值的标准差远大于后者。

2.22组大鼠不同时期24hPro的变化结果见表1。由表1可知，造模24 d高蛋白饲料组大鼠24 h Pro随着观察时间的延长而升高，且高于对照组。

表1　2组大鼠不同时期24 h Pro的变化　mg

F组间=3 705.105,F时间=559.219,F交互=549.318,P均<0.001；*：与对照组比较，P<0.05

2.32组大鼠不同时期水肿程度的变化结果见表2。由表2可知，造模24 d，与对照组相比，高蛋白饲料组大鼠表现出明显的水肿，且随着观察时间的延长水肿逐渐加重。

表2　2组大鼠不同时期水肿程度的变化　%

F组间=4 756.500,F时间=71.890,F交互=49.953,P均<0.001；*：与对照组比较，P<0.05

2.42组大鼠不同时期血清白蛋白和尿素氮水平比较结果见表3、4。与对照组相比，高蛋白饲料组大鼠在造模24 d后血清白蛋白水平降低，之后持续降低；与对照组相比，高蛋白饲料组动物大鼠血清尿素氮水平在给药后39 d开始升高。

表3　2组大鼠不同时期血清白蛋白水平的比较　g/L

F组间=90.749,F时间=9.081,F交互=11.523,P均<0.001；*：与对照组比较，P<0.05

表4　2组大鼠不同时期尿素氮水平的比较　mmol/L

F组间=59.345,F时间=54.255,F交互=58.265,P均<0.001；*：与对照组比较，P均<0.05

2.5肾脏组织形态学观察实验结束时，对照组、高蛋白饲料组动物的脏器系数分别是(0.74±0.04)、(1.29±0.18)，后者高于前者(t=7.248，P<0.01)。2组肾组织电镜结果如图1上排所示。造模24 d，对照组肾小球各结构无病变，足细胞足突清晰、明显，肾小球基底膜完整，均匀一致，高蛋白饲料组足细胞足突发生部分融合，基底膜厚度不均一；实验结束时对照组肾小球足细胞足突正常，肾小球基底膜完整，均匀一致，高蛋白饲料组可见足突广泛融合、裂隙消失，基底膜显著增厚。 PAS染色结果如图1下排所示。造模24 d，光镜下对照组未见异常，高蛋白饲料组肾小球未见病变，但肾小管管腔肿胀，有颗粒变性；实验结束时光镜下对照组肾小球、肾小管和间质均未见结构异常，高蛋白饲料组可见肾小球基底膜节段增厚，球囊粘连，呈现显著的肾小球节段性硬化，肾小管上皮细胞层空泡变性，存在大量蛋白管型。

1：电镜，标尺1 900.00 nm；2：肾脏PAS(×400)；A、B:造模24 d的对照组和高蛋白饲料组；C、D:实验结束时的对照组和高蛋白饲料组图1　各组大鼠肾组织电镜观察和PAS结果

3　讨论

ADR是含醌的蒽环抗生素，在临床上作为肿瘤化疗药物广泛应用,可在肾脏内代谢还原为半醌型自由基。后者与氧反应产生活性氧，诱发肾小球上皮细胞脂质过氧化反应，破坏滤过膜的结构和功能，导致膜滤过屏障的选择性变化而引起蛋白尿[4]。ADR的肾毒性及大量蛋白尿的产生进一步诱发肾小球内固有细胞及其他炎性细胞产生并释放各种细胞因子和炎性介质，刺激肾小球系膜细胞增殖和系膜基质增多，缓慢发展形成肾小球硬化[5-6]。以上研究结果提示ADR诱导肾病具有慢性和自我进展的特性，这也是人类慢性进展性肾病的特征。根据ADR对肾脏毒性的特点，实验研究中可分为急性肾病模型和慢性肾病模型。急性肾病模型类似于人微小病变型肾病,而慢性肾病模型类似于人慢性肾小球肾炎和局灶节段性肾小球硬化。

许多因素会影响ADR肾病模型的稳定性。提高模型成功率和降低动物个体差异是动物疾病模型复制过程中需要解决的两个问题。我们在预实验中曾采用与本研究报道同批次的ADR第1次尾静脉注射4.0 mg/kg，间隔1周，注射相同剂量的ADR，虽然在20 d后模型成功率可达90%，但后期用药期间，模型大鼠因ADR的严重毒性，一直持续腹泻，且经常出现口鼻出血现象，死亡率高、动物个体间24 h Pro差别也比较大。即使将第2次注射ADR的剂量减低到3.5 mg/kg，动物腹泻减少，但仍然出现动物死亡率高、动物个体间24 h Pro差别大的问题。后来经过多次反复试验，发现在饲料中添加20%大豆分离蛋白可以显著提高动物的存活率，不仅如此，模型动物个体间24 h Pro的差异亦明显减少，这对于后期研究十分有利。据报道[7-9]，大豆分离蛋白有减少脂质在肝脏中的积累，加强排泄和抑制脂肪吸收，减缓实验动物和受试者的肾损伤进展，降低血压，改善血脂水平的作用。对于5/6肾脏切除大鼠模型，大豆分离蛋白可以有效降低血压和胆固醇，并具有减轻肾脏损伤的作用，对于人的2型糖尿病和肾病也有减轻尿蛋白和改善血脂的作用。此外，据报道[10-11]，大豆分离蛋白可以改善血脂异常的胰岛素抵抗模型大鼠脂肪组织功能障碍，改善糖尿病大鼠氧化应激。而大豆分离蛋白对肾脏损伤的保护作用是否与其抗氧化作用有关，有待进一步研究探讨。

我们通过电镜观察到高蛋白饲料组自第1次给ADR后24 d，24 h Pro大于30 mg时，光镜下可见肾小球正常，电镜下可见足细胞足突足发生部分融合，基底膜厚度不均一，说明大鼠有类似临床患者的微小病变型肾病。在此基础之上，我们又继续动态观察了4周，发现高蛋白饲料组大鼠24 h Pro持续增加，从造模24 d时的36.7 mg逐渐增至293.5 mg；血清白蛋白则持续降低，第39天起血清尿素氮显著升高；水肿也更加明显，可见随着观察时间的延长，各种症状逐渐加重， ADR的毒性呈现渐进性增加；在实验结束，即造模第52天通过电镜观察到足突广泛融合、消失，基底膜明显增厚。说明动物出现了肾小球节段性硬化的病变。我们也对该模型进行了长达5个月的观察，发现模型动物在观察期间24 h Pro持续升高，肾小球节段性硬化的病变更加恶化。当然该模型在应用中还应注意ADR的批次不同，其24 h Pro会有所差异，所以需要做预实验来确定ADR的剂量，同时ADR易渗漏到血管外引起组织坏死，也使得进入动物体内的ADR的量不准确，所以熟练掌握大鼠尾静脉注射也是十分必要的。

总之，本研究通过两次给予ADR后在动物饲料中添加大豆分离蛋白构建大鼠ADR肾病模型，操作简便，建模时间短，成功率高；模型大鼠间24 h Pro等指标变异小，重复性和稳定性好；该模型大鼠的病变时间长，病情持续加重，有利于动态观察慢性肾病的进展和变化，为肾病研究以及新药作用观察提供了基础。

致谢：感谢郑州大学医药科学研究院代丽萍教授在数据统计处理方面给予的指导。

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