高通量测序技术在检测循环肿瘤细胞中的应用

许芳 赵阳 武其文

肿瘤是威胁人类生命健康的一大重要因素，据统计全球1/8的死者死于癌症，我国每一分钟有6人确诊为癌症。由于传统成像技术固有的局限性和缺乏特异性的肿瘤标志物导致多数恶性肿瘤预后不良和5年生存率较差。找到一种合理有效的方法对肿瘤患者进行早期诊断和治疗具有重要意义，循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）作为新兴的肿瘤标志物，可用于筛查、检测、诊断、预后预测、分层、治疗反应监测等。已证明在乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌等恶性肿瘤中，CTCs计数可作为独立的预后判断指标。但外周血中CTCs数量的稀有及其结构的异质性和聚集特性是影响其分离和分析的主要障碍［1］。几种较常见的循环肿瘤细胞检测实验方法：免疫细胞化学法、逆转录聚合酶链反应、纳米免疫磁珠富集检测法等，由于自身各自的缺点在临床应用中均受到不同程度的限制。目前，基因组学家强调对原发性肿瘤和部分转移灶进行大规模测序以全面分析和理解癌症基因组特征［2］。高通量测序从分子层面对CTCs进行基因序列分析以适应临床需要。该技术采用大规模平行测序，能够一次对数百万至数十亿个DNA片段进行序列测定，可完成在相对较低成本及不增加样本量情况下，对上百个肿瘤相关基因、全外显子以及全基因组进行检测。高通量测序技术与CTCs的综合运用在未来研究中展现出广阔的前景，本文就二者的应用作一综述。

1 循环肿瘤细胞

1.1 循环肿瘤细胞概述

CTCs常作为循环上皮细胞被检测，在健康人群中非常罕见，但在各种实体瘤患者血液中可检测到［3］，被称为新兴的肿瘤标志物，早在100多年前被提出，是原发性或转移性肿瘤脱落进入到外周血液循环中的肿瘤细胞［4⁃5］。CTCs与原发肿瘤具有相似的遗传特征，并可携带这些遗传信息随血液循环播散至全身各个器官［6］。原发肿瘤每天可释放上万个肿瘤细胞，但只有约0.01%CTCs可存活。有研究者采用白细胞分离法分别从7例直肠癌患者、5例乳腺癌患者以及3例胃癌患者外周血中获得平均循环肿瘤细胞数各为 17.1（10⁃34）、10.0（2⁃27）、24.0（2⁃42），并对这些CTCs进行了成功培养［7］。随着对CTCs的深入研究发现CTCs在血液运行过程中部分会发生上皮间质转化（epithelial mesenchy⁃mal transition，EMT），这与干细胞表型有关，且EMT可帮助CTCs抵抗细胞凋亡信号，更好的存活和躲避治疗药物的攻击，增强侵袭迁移能力［1］。CTCs表现出的这些生物学特点是我们甄选CTCs作为研究肿瘤的依据，是机遇也是挑战，未来需要更深入的研究。

1.2 循环肿瘤细胞临床价值

CTCs的临床应用范围从诊断、预后预测、合理治疗方案选择到临床病理分期等。如根据早期肿瘤患者或术后近期内血液中有无CTCs再评估是否需要对那些具有高危转移因素的患者进行放化疗方面有重要指导作用［8］。CTCs可作为评估晚期癌症患者治疗是否有效的早期指标以及发现潜在靶向治疗的新方法［9］。在结直肠癌中，KRAS基因的外显子2突变是表皮生长因子受体抑制剂治疗的不利标志［10］。CTCs还可能为原发性肿瘤和转移肿瘤的分析提供遗传信息。鉴于疾病发展过程中，恶性肿瘤可能会发生获得性遗传变异，CTCs作为一个实时的液体活检可避免对转移组织进行多次侵害性的病理活检［11］。此外，CTCs计数还可作为监测化疗疗效的标志物，评估乳腺癌和前列腺癌患者对化疗的反应［12⁃14］。根据 Scher和 Jia等［15］2 008 项研究数据分析发现，CTCs计数作为一个连续变量分析时，结合乳酸脱氢酶基点是一个重要的预后变量（一致性概率估计0.72至0.75）。在用醋酸阿比特龙治疗前列腺癌的第二阶段，有研究者根据治疗后CTCs的变化评估47位难治性、去势抵抗的前列腺癌患者对治疗的反应，结果显示治疗后CTCs数量明显减少，且ERG基因的重排和CTCs数量的减少之间具有明显的相关性（r=0.762，P=0.001）［16］。对于膀胱癌切除术患者而言术前CTCs的存在是无癌生存期的独立的不良预兆。最近一项研究表明CTCs依然是膀胱癌患者接受膀胱癌根除术但没有辅以化疗的癌症特异性死亡率的独立预兆［17］。

综合上述观点我们不难发现CTCs作为一种液体活检标本，相比于影像学、病理组织学，血清标志物具有独特的优势，能够提供更多的临床信息。

2 循环肿瘤细胞检测方法

2.1 免疫学技术

检测CTCs最具有代表性的免疫学技术是基于免疫磁珠平台的Cellsearch系统，该系统是目前唯一得到美国食品和药物管理局批准的CTCs检测系统［18］。该方法利用包被有上皮细胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）抗体的免疫磁珠，通过抗原抗体反应与外周血中所有表达EpCAM的细胞结合，从而分离捕获CTCs，然后利用荧光标记的细胞角蛋白（cytokeratins，CK）抗体对CTCs进行识别鉴定。然而，关于是否所有的循环CK细胞都是肿瘤细胞仍然存在争议。相反，对于重要的细胞亚群，如发生EMT的细胞存在漏检，且因其无法检测EpCAM阴性的细胞，使得检测CTCs的敏感性和特异性降低。Li等［19］应用Cellsearch系统和依据细胞大小的膜滤法（isola⁃tion by size of epithelial tumor，ISET）对 61 例食管鳞状细胞癌患者进行检测，ISET方法检测出CTCs有20例（32.8%），检测出循环肿瘤微栓子3例（4.9%），而Cellsearch系统分别检测出1例（1.6%）和0例。另外，该方法主要侧重于循环肿瘤的计数，缺乏在基因层面的深入，在展现信息全面方面表现出一定的弊端，一项转移性乳腺癌患者的研究报告显示单纯根据CTCs计数转换治疗并不能提高患者的总体生存率［20］。免疫学技术作为一种传统检测方法，应用广泛，但随着技术发展其弊端日益凸显。

2.2 CTCs芯片技术

CTCs芯片技术使用抗EpCAM抗体包被的微流体装置，基于EpCAM经常在肺癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、头颈部肿瘤中过度表达，能够从血液中特异性捕获CTCs，细胞可快速分离并可视化，早期研究表明该技术在多种转移癌中的检出率达99%，且CTCs的数量多（平均50 CTCs/mL）［21⁃22］。然而，该技术主要用于 CTCs的捕获和分离，因仍以抗体为基础，同样可因肿瘤细胞发生EMT，上皮抗原消失而敏感性降低。

2.3 逆转录 PCR（reverse transcription PCR，RT⁃PCR）技术

自20世纪90年代以来，RT⁃PCR开始用于检测外周血中的肿瘤特异性核苷酸［10］。相比于依赖抗体结合的检测方法其敏感性明显提高，且可用于检测血液中游离的RNA，应用范围广。但限于常见的靶RNA的非特异性表达、标本及PCR产物的污染、PCR扩增过程中条件控制不当、非特异性细胞低水平的非法转录等原因，使RT⁃PCR方法的检测结果出现较高的假阳性率。此外，该技术无法用于观察肿瘤细胞的形态学特征。

3 高通量测序在循环肿瘤细胞检测中的应用

3.1 高通量测序技术

高通量测序又称下一代测序（next generation se⁃quencing，NGS）或深度测序，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短著称，引起业内广泛关注。2015年初，国家卫生和计划生育委员会首次批准了26家肿瘤诊断与治疗采用高通量测序技术的应用试点单位，这预示着我国正逐步进入规范化的肿瘤高通量测序检测行列。高通量测序检测CTCs的实验过程主要包括：抽取CTCs DNA⁃制备测序文库⁃测序⁃生物信息分析，获取高纯度的CTCs DNA是检测的前提，而先进的生物信息学分析技术是获取检测结果的保障。

3.2 高通量测序的应用

3.2.1 结直肠癌

高通量测序可揭示体细胞单核苷酸多态性和拷贝数变化，2013年 Heitzer等人［23］利用高通量测序技术对68个结直肠癌相关基因进行序列分析，比较原发肿瘤和转移灶的突变谱及相应的CTCs，在相应的CTCs中检测到已知的原发肿瘤和转移灶的突变驱动基因［如结肠腺瘤样息肉（APC），KRAS，PIK3CA］，并发现CTCs也存在基因突变。并且，利用深度测序分析这些突变的来源，发现原本在CTCs检测出的大多数突变也存在于原发肿瘤和转移灶。检测肿瘤基因拷贝数往往受到正常细胞掺杂和非整倍数因素的影响，且正常细胞会干扰肿瘤细胞的基因信号，给全面分析肿瘤基因带来挑战，下一代测序技术提供了精确到碱基水平的基因信息，使检测不同类型的基因变异以及确定基因片段大小、位置等信息成为可能。

3.2.2 胰腺癌

RNA测序可显示肿瘤转移的相关路径，有研究人员采用微流控器对来自小鼠胰腺癌模型的内源性CTCs进行高效捕获，并对CTCs进行单分子RNA测序，可筛选出Wnt2作为候选基因在CTCs中表达活跃［24］。在胰腺癌细胞中通过Wnt2的表达抑制失巢凋亡，增强非依赖贴壁球体的形成，增加体内转移倾向。胰腺肿瘤细胞形成非粘附的肿瘤球体与多个Wnt基因表达上调有关，11例胰腺癌中有5例CTCs的Wnt信号表达丰富。由此对CTCs进行分子分析可确定治疗靶点，预防肿瘤远处扩散。

3.2.3 肺癌

有研究显示通过对肺癌的CTCs外显子组进行测序可发现其转移和突变。Ni等人［25］对11例肺癌患者的CTCs进行外显子基因组测序分析，发现特征性肿瘤相关的单核苷酸变异和CTCs外显子的插入和缺失。这些突变可提供个体化治疗所需的信息，如耐药和表型转变。此外，同一病人的每个CTCs，无论肿瘤亚型，具有的重复性拷贝数变异（copy number variation，CNV）模式与转移瘤类似，同样是肺腺瘤的不同患者，CTCs的CNV模式相似，而小细胞肺癌患者的CNV明显不同于肺腺瘤患者。这表明特定基因位点的CNV可提示癌症转移，肿瘤特异性CNV的重复性提供了潜在的基于CTCs的临床诊断价值。

3.2.4 膀胱移行细胞癌

2013年Guo等［26］利用全基因和全外显子测序对99例膀胱移行细胞癌患者基因组进行分析，除了证实已被确定在移行细胞癌（transitional cell car⁃cinoma，TCC）中发生突变的基因外，还发现STAG2和ESPL1基因频繁的突变以及FGFR3和TACC3重复性融合在姐妹染色单体的结合和分离（sister chromatid cohesion and segregation，SCCS）过程中发挥重要作用。研究表明基因突变对SCCS过程的影响可能参与了膀胱肿瘤的发生，为找到一种新的治疗方法提供了思路。Sharron等［27］在2014年利用RNA测序对膀胱移行细胞癌进行分析，确定了一个在T1NPBCa（T1 nonprogressive bladder cancer）和 T1PBCa（T1 progres⁃sive bladder cancer）间表达差异显著的基因标志。基于特征的分层显示基因识别标志与肿瘤由T1期发展到T2期的时间密切相关，表明分子标志可作为高评分T1膀胱癌发展的独立预测因子。

3.2.5 头颈癌

受各种因素的影响，近年来头颈部肿瘤的发病率和致死率持续上升，其中以青年患者尤为突出，美国在2014年有73 240例患者确诊为头颈癌，27 450例患者死于头颈癌［28］。早在2011年发表在Science杂志上的2篇文章同时报道了利用高通量测序技术对头颈部鳞癌进行分析，发现在头颈部肿瘤患者中存在大量的碱基突变，其中以TP53、CDKN2A、PIK3CA、NOTCH1基因的突变最为普遍，在HPV阴性的肿瘤患者中，这种突变更为常见［29⁃30］。2014 年有学者对TP53、NOTCH1基因在头颈肿瘤中的变化进行了更为详细深入的研究和报道［31⁃32］。Farah等［33］分别从转化性研究、个性化医学、验证目标基因、癌症药物基因组、药物靶点、未来可能采取的治疗方法等方面详细描述了NGS在头颈癌中的应用。

3.2.6 乳腺癌

对乳腺肿瘤进行分子层面分析可促进耐药机制的研究，如雌激素受体靶向治疗乳腺癌出现耐药是由于ESR1基因发生了突变［34］。由于血液CTCs非常少，高纯度的DNA量获取困难，一般难以达到高通量测序平台检测的下限，这也是高通量测序技术的一大重要挑战。最近的一项研究很好的解决了这一问题，该研究综合运用全基因组扩增（whole genome amplification，WGA）和NGS对比分析了乳腺癌细胞株和经乳腺癌细胞株转染而成的癌细胞，提出在WGA过程中使用DNA无创管可解决WGA试验与细胞固定剂不相容问题［35］。

通过上述实例，我们不难看出高通量测序技术在检测循环肿瘤细胞，从分子层面研究肿瘤疾病等方面具有重大的应用价值。相信随着技术的不断发展和完善，高通量测序技术可以揭示更多的肿瘤基因信息，为肿瘤的预防、诊断、治疗奠定夯实的理论基础，为肿瘤病人带去真正的福利。

4 展望

目前，人们越来越重视从基因层面分析肿瘤疾病，CTCs很早就开始进入人们视野，但限于在外周血中的量稀少以及受技术的限制，无法广泛应用。近年来，随着各种CTCs富集和检测技术的发展，尤其是在高通量测序技术的推动下，CTCs又重新受到人们的关注。对CTCs的研究有利于更好的理解为什么同一种癌症中的细胞具有不同的侵袭和转移能力、对同一种药物产生不同的治疗效果，更好的为癌症患者提供个体化的治疗方案。2015年国家卫生计生委妇幼司发布了第一批高通量测序技术临床应用试点单位，这是对高通量测序的高度认可。高通量测序技术应用的范围非常广泛：人类千人基因组计划、动植物全基因组研究、表观遗传研究和甲基化分析、微生物基因组测序组装、外显子组基因测序分析、小RNAs序列分析、单细胞全基因组测序等等。目前高通量测序呼声最响的是在无创产前诊断中的应用。近期我院正着力于高通量测序技术平台实验室的创建，高通量测序进入公众视野指日可待。

为了使高通量测序技术更好地走进临床，发挥更大的应用价值，应与其它技术更好的结合，如高效的细胞分离和富集技术，全基因组扩增技术。另外，要加快精密型实验室的建设。此外，高通量测序技术对科研工作者和临床医生来说是一个新的领域，在测序过程中产生庞大的数据需依赖于复杂的生物信息学技术分析，这并不是简单易懂的，为此应该朝着更加简捷化和自动化发展。最后高通量测序技术作为一种新兴的技术，还处在探索前进阶段，应朝着更加规范化发展，真正发挥其价值。总之随着高通量测序技术的临床开展和各技术环节的日益完善，其必将结出丰硕之果，我们深信基于测序技术的基因数据分析方法将成为主流发展方向，有望改变个性化医疗的前景。

［1］Mego M，Mani SA，Cristofanilli M.Molecular mech⁃anisms of metastasis in breast cancer⁃clinical applica⁃tions［J］.Nat Rev Clin Oncol，2010，7（12）：693⁃701.

［2］Hudson TJ，Anderson W，Aretz A，et al.Internation⁃al network of cancer genome projects［J］.Nature，2010，464（7291）：993⁃998.

［3］Schwarzenbach H，Alix⁃Panabières C，Müller I，et al.Cell⁃free tumor DNA in blood plasma as a marker for circulating tumor cells in prostate cancer［J］.Clin Can⁃cer Res，2009，15（3）：1032⁃1038.

［4］Haber DA，Velculescu VE.Blood⁃based analyses of cancer：circulating tumor cells and circulating tumor DNA［J］.Cancer Discov，2014，4（6）：650⁃661.

［5］Heitzer E，Auer M，Ulz P，et al.Circulating tumor cells and DNA as liquid biopsies［J］.Genome Med，2013，5（8）：73⁃84.

［6］Sarrio D，Franklin CK，Mackay A，et al.Epithelial and mesenchymal subpopulations within normal basal breast cell lines exhibit distinct stem cell/progenitor properties［J］.Stem Cells，2012，30（2）：292⁃303.

［7］Soya R，Taguchi J，Nagakawa Y，et al.A large num⁃ber of circulating tumor cells（CTCs） can be isolated from samples obtained by using leukapheresis proce⁃dures［J］.Gan To Kagaku Ryoho，2015，42（9）：1069⁃1072.

［8］Gerges N，Rak J，Jabado N.New technologies for the detection of circulating tumour cells［J］.Br Med Bull，2010，94（1）：49⁃64.

［9］Matsusaka S，Suenaga M，Mishima Y，et al.Circulat⁃ing tumor cells as surrogate marker for determining re⁃sponse to chemotherapy in Japanese patients with meta⁃static colorectal cancer［J］.Cancer Sci，2011，102（6）：1188⁃1192.

［10］Walther A，Johnstone E，Swanton C，et al.Genetic prognostic and predictive markers in colorectal cancer［J］.Nat Rev Cancer，2009，9（7）：489⁃499.

［11］Small AC，Gong Y，Oh WK，et al.The emerging role of circulating tumor cell detection in genitourinary cancer［J］.J Urol，2012，188（1）：21⁃26.

［12］Rack B，Schindlbeck C，Jückstock J，et al.Circulat⁃ing tumor cells predicted survival in early average⁃to high risk breast cancer patients［J］. J Natl Can⁃cer Inst，2014，106（5）：2504⁃2511.

［13］Bidard FC，Peeters DJ，Fehm T，et al.Clinical validi⁃ty of circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer：a pooled analysis ofindividual patient da⁃ta［J］.Lancet Oncol，2014，15（4）：406⁃414.

［14］Scher HI，Heller G，Molina A，et al.Circulating tu⁃mor cell biomarker panel as an individual⁃level surro⁃gate for survival in metastatic castration ⁃resistant pros⁃tate cancer［J］.J Clin Oncol，2015，33（12）：1348⁃1355.

［15］Scher H，Jia XB，Fleisher M，et al.Circulating tu⁃mour cells as prognostic markers in progressive，castra⁃tion⁃resistant prostate cancer：a reanalysis of IMMC38 trial data［J］.Lancet Onco，2009，10（3）：233⁃239.

［16］Reid AH，Attard G，Danila DC，et al.Significant and sustained antitumor activity in post⁃docetaxel，castra⁃tion⁃resistant prostate cancer with the CYP17 inhibitor abiraterone acetate［J］.J Clin Oncol，2010，28（9）：1489⁃1495.

［17］Alva A，Friedlander T，Clark M，et al.Circulating tu⁃mor cells as potential biomarkers in bladder cancer［J］.J Urol，2015，194（3）：790⁃798.

［18］Krebs MG，Metcalf RL，Carter L，et al.Molecular analysis of circulating tumour cells⁃biology and bio⁃markers［J］.Nat Rev Clin Oncol，2014，11（3）：129⁃144.

［19］Li H，Song P，Zou B，et al.Circulating tumor cell analyses in patients with esophageal squamous cell car⁃cinoma using epithelial marker dependent and ⁃indepen⁃dent approaches［J］.Medicine（Baltimore），2015，94（38）：e1565.

［20］Smerage JB，Barlow WE，Hortobagyi GN，et al.Cir⁃culating tumor cells and response to chemotherapy in metastatic breast cancer：SWOG S0500［J］.J Clin On⁃col，2014，32（31）：3483⁃3489.

［21］Nagrath S，Sequist LV，Maheswaran S，et al.Isola⁃tion of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology［J］.Nature， 2007，450（7173）：1235⁃1239.

［22］Stott SL，Hsu CH，Tsukrov DI，et al.Isolation of cir⁃culating tumor cells using a microvortex⁃generating herringbone⁃chip［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（43）：18392⁃18397.

［23］Heitzer E，Auer M，Gasch C，et al.Complex tumor genomes inferred from single circulating tumor cells by array⁃CGH and next⁃generation sequencing［J］.Can⁃cer Res，2013，73（10）：2965⁃2975.

［24］Yu M，Ting DT，Stott SL，et al.RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT sig⁃nalling in metastasis［J］.Nature，2012，487（7048）：510⁃513.

［25］Ni X，Zhuo M，Su Z，et al.Reproducible copy num⁃ber variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2013，110（52）：21083⁃21088.

［26］Guo G，Sun X，Chen C，et al.Whole⁃genome and whole⁃exome sequencingof bladder cancer identifies frequent alterations in genes involve⁃d in sister chroma⁃tid cohesion and segregation［J］.Nat Genet，2013，45（12）：1459⁃1463.

［27］Sharron LX，Hu L，Sandy K，et al.Differentiating progressive from nonprogressive T1 bladder cancer by gene expression profiling：applying RNA⁃sequencing analysis on archived specimens［J］.Urol Oncol，2014，32（3）：327⁃336.

［28］Siegel R，Ma J，Zou Z，et al.Cancer statistics，2014［J］.CA Cancer J Clin，2014，64（1）：9⁃29.

［29］Stransky N，Egloff AM，Tward AD，et al.The muta⁃tional landscape of head and neck squamous cell carci⁃noma［J］.Science，2011，333（6046）：1157⁃1160.

［30］Agrawal N，Frederick MJ，Pickering CR，et al.Exome sequencing of head and neck squamous cell car⁃cinoma reveals inactivating mutations in NOTCH1［J］.Science，2011，333（6046）：1154⁃1172.

［31］Song X，Xia R，Li J，et al.Common and complex notch1 mutations in Chinese oral squamous cell carci⁃noma［J］.Clin Cancer Res，2014，20（3）：701⁃710.

［32］Gaykalova DA，Mambo E，Choudhary A，et al.Nov⁃el insight into mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma［J］.Plos One，2014，9（3）：e93102.

［33］Farah CS，Jessri M，Kordbacheh F，et al.Next⁃gener⁃ation sequencing applications in head and neck oncolo⁃gy［J］.Springer International Publishing，2015，2（23）：401⁃422.

［34］Robinson DR，Wu YM，Vats P，et al.Activating ESR1 mutations in hormone⁃resistant metastatic breast cancer［J］.Nat Genet，2013，45（12）：1446⁃1451.

［35］Yee SS，Lieberman DB，Blanchard T，et al.A novel approach for next⁃generation sequencing of circulating tumor cells［J］.Mol Genet Genomic Med，2016.Epub ahead of print.