人类微生物组学与健康及其临床检验的需求

王庆忠 范云 沈祁烨

微生物与人类共生了数百万年，在基因构成和代谢功能上与宿主形成“超生物体（Superorgan⁃ism）”，微生物种属构成、相互作用、遗传进化与人类的健康和疾病密切相关。传统研究方法依赖于菌株分离与纯培养，通过表型和生化特性鉴定，研究的微生物不到1%，不能在深度和广度上发掘余下众多微生物群系的系统发育及群落功能。近20年来高通量测序、生物信息学等现代生物学技术和大数据处理技术的发展，逐渐建立了以16S rDNA系统分析为基础，宏基因组为发展方向的整体微生物组学研究方法。本文通过介绍微生物组学概念及其与疾病的关系和研究技术，探讨微生物组学临床应用和对诊断的需求，便于加深对这一新兴学科的认识，有利于该技术在临床更好地应用。

1 人类微生物组学概念及与健康的关系

1.1 人类微生物组学概念

人体皮肤、呼吸道、消化道、生殖系统等部位共生的微生物群落数量庞大，涵括病毒、古菌、细菌和真菌等微生物类型，成人体表和体内的微生物细胞估计是人类自身细胞的10倍，占体重的1%～2%［1⁃2］。为了解析人类健康和疾病与微生物群系的关系，研究者提出人类微生物组（human microbi⁃ome）或者“宏基因组（megagenome）”的概念。人类微生物组是人出生以后才进入人体与人类共生的位于身体不同部位的完整的人类微生物菌群基因组信息的总和［3］。宏基因组（metagenome）和宏转录组（metatranscriptome）指全基因组和RNA来源的特定的微生物基因转录本的总和。病毒组（virome）主要是指所有病毒的基因组，真菌组（mycobiome）主要是指所有真菌的基因组。

21世纪初，2个宏大的国际人类微生物组项目，由欧洲主导的人体肠道宏基因组学（metagenomics of human intestinal tract，MetaHit）和由美国主导的人类微生物组计划（human microbiome project，HMP）开始聚焦人体中的微生物群系。2016年5月，美国白宫科学和技术政策办公室宣布启动“国家微生物组计划（national microbiome initiative，NMI）”。经过十余年的研究，2个计划发布初步研究成果。MetaHit分析了来自健康人、超重和肥胖的成年人以及肠炎病患者124种肠道细菌的330万条非冗余基因，据估计，在人类肠道微生物存在超过1 000种细菌［4⁃5］。HMP初步分析178个与人类宿主有关的细菌基因组序列［6⁃7］。

1.2 微生物组与人类健康的关系

人体同微生物群体之间是共生与互惠关系。宿主为微生物提供保护和丰富的营养，微生物则为宿主提供消化、免疫和神经系统发育等支持和协作。研究表明，微生物与诸多重大人类疾病息息相关，如肥胖症、糖尿病、自闭症、抑郁症、过敏症、炎症性肠道疾病、心血管疾病、多种癌症等代谢、精神、免疫类疾病。

研究较为全面的是人类的肠道菌群与宿主之间的相互作用。肠道微生物与人类肥胖、营养物质（如糖类、短链脂肪酸）的吸收、重要维生素（维生素K、维生素B12）的产生、潜在致癌物质的脱毒等高度相关。肠道微生物基因组的测序工作揭示，微生物影响肠道血管生成和运动，减少肠道屏障的通透性，提高肠道免疫能力［8］。肠道微生物群系的定植和种群构成影响因素众多。首先是出生时分娩方式，其次是早期的生活饮食类型，随着年龄的增长，个人微生物群系逐渐稳定［9］。成年人肠道菌群的组成一般以严格厌氧菌为主，厚壁菌和拟杆菌类最为丰富，其次是变形杆菌、放线菌［10］。每个个体肠道微生物群系具有一定的独特性，只有不到30%微生物为个体之间所共享［11］。华大基因研究院、欧洲分子生物学实验室和深圳大学医学院等单位完成的“肠道微生物与Ⅱ型糖尿病的宏基因组关联分析”，识别了约6万个Ⅱ型糖尿病候选生物标记物，并成功应用于糖尿病的临床评定和病人诊断［4］。

神经退行性疾病与肠道微生物组的关系密切。淀粉样蛋白与神经退行性疾病，特别是阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）密切相关。人体微生物产生的淀粉样蛋白与AD、异常行为、自闭症等神经退行性疾病的发病率存在一定关联［12⁃13］。细菌淀粉样蛋白可以激活TLR2、NFκB、TLR1、CD14等炎症分子［14］。TLR2导致notch1上调，notch1在AD的发展中起着关键的作用［15］。在胃部，健康人的胃是以普氏菌、链球菌、韦荣球菌、罗思氏菌和嗜血杆菌为主［16］。幽门螺杆菌是慢性胃炎患者的主导菌群，该菌在肠道菌群和其他物种之间的相互作用可能会导致胃癌高发；数量众多的链球菌属与胃窦炎有关［17］。胃癌患者和健康人群之间胃部菌群的大类差异不显著，差异主要体现在链球菌、乳酸杆菌、韦荣球菌、普氏菌等大类菌群的具体菌种差异上。在肺脏，微生物调节机体免疫防御病毒感染。在神经系统方面，微生物还通过减少突触连接，调节焦虑和痛感等影响人类行为。

2 微生物组学研究主要技术

微生物组学是新兴学科，它的发展与高通量基因测序和大数据的生物信息学分析密切相关。主要通过2种方式研究微生物组，一是通过16S rDNA基因序列的测定，提供一个全景式的微生物组成；二是通过宏基因组数据分析，深度揭示上述微生物已知和潜在的功能。

2.1 基于16S rDNA基因序列的微生物组学研究

16S rDNA的测序是近年来微生物生态领域最核心、最具突破性的技术。通过Roche 454焦磷酸测序、Illumina Solexa合成测序等第二代测序仪高通量测定16S rDNA可变区序列，获得全面、系统、结构化的群落结构信息。该方法设计针对16S rDNA基因的V3⁃V1、V2⁃V4、V4、V3⁃V6、V9等不同区域的引物，通过PCR和高通量基因测序，生物信息学分析测序结果。大数据分析一般流程包括：序列提取、质控、相似序列聚类分析（operational taxo⁃nomic unit，OTU）、种属分类、alpha以及beta多样性分析等［18⁃19］，OTU是 16S rDNA 序列分析的关键控制点之一。

16S rDNA的测序通过提供丰富的全局性物种类群信息，可在微生物集群的层面揭示它们之间的相互作用。但方法局限在于注释是基于OTU，一般情况下仅可将微生物分析到科或属水平，不能精确地鉴定到物种水平。同时特定的基因并不直接测序，加之微生物间基因水平转移和数量众多未知菌株的存在［20⁃21］，极大地限制对未知微生物的发现和进一步研究。

2.2 基于微生物组学的宏基因组研究

基于全基因测序的宏基因组技术，通过鸟枪法高通量测序，可以在获得菌群分类数据的同时采集到功能基因信息。此外该技术可以减少PCR扩增导致的偏差，原因在于检测时一般直接测序。宏基因组数据分析常包括如下步骤：序列质控——序列组装（也可不经组装，直接比对目标数据库）——比对检测序列与已知微生物基因数据（统计门、纲、目、科、属、种的分类和丰度）--比较物种多样性（如采用PCA分析、聚类分析、筛选与样品分组显著相关因子）——分析基因组份（前噬菌体预测、可转座原件、基因预测）——功能注释（比对KEGG、egg⁃NOG、CAZy等数据库，分析代谢通路、主要化合物活性酶、同源性）——抗生素耐药组的比对分析等［22-24］。

宏基因组测序和16S rDNA测序尽管在菌群分布上基本一致［25］，但分辨率差异显著。Ⅱ型糖尿病患者肠道菌群和对照人群在群落层面，并无显著不同；而在功能基因上，宏基因组揭示的信息量却显著多于 16S rDNA 测序［4，26］。宏基因组技术仍然存在一些技术难题需要解决。首先，通过常规的序列相似度注释基因功能，对某些基因而言不准确也存在一定量的误注；其次，存在无法找到匹配的数据库序列，这在病毒组由甚，有多达80%的序列无法找到匹配；再次，对于低丰度的菌株的微生物基因组，通过宏基因组难以将其进行组装拼接。

3 临床应用及检验需求

人类微生物组的基础研究为本方向的临床应用提供了坚实的基础。本学科正处于从现象描述、关联分析，到机制研究、模型干预，逐渐向疾病诊断、预测和治疗的井喷式发展。该技术应用于临床需要保证在不同实验室之间结果的一致性，对检验前、中、后3个阶段进行全程质量管理。

3.1 微生物组的临床应用

在临床应用人类微生物组可从3个侧面展开：加法，即添加或补充自然或工程微生物菌群；减法，消减或消除宿主体内有害微生物菌群；调节治疗，通过非生物制剂或益生元，调节宿主内源微生物群的组成和活性［27⁃28］。

益生菌和益生元构成的第一代微生物组疗法已经在临床得到了越来越多的应用［20⁃31］。Shanahan等［32］研究发现炎症性肠道疾病患者与非患者之间的菌群存在显著差异，通过对人体微生物组的干预和调整，达到治疗和预防疾病的目的。在临床上给患者喂服具有胆盐水解酶活性的罗伊氏乳杆菌菌株，通过调节胆汁酸池水平从而降低胆固醇水平［33⁃34］。

消减疗法可使用化学物质、多肽等去除患者体内特定的微生物种群。细菌素是由核糖体合成的抗菌肽，可以对易感菌产生细胞毒性。利用宏基因组学鉴定、筛选和使用对特定病原体定向杀灭细菌素，调节微生物种群［35⁃36］。另外，噬菌体疗法通过自然或工程化的噬菌体杀灭特定细菌，细菌和噬菌体种群稳定共存于健康小鼠肠道［37］。

设计特定的微生物群系和选择性的抗菌药物所构成的新一代重组益生菌，已为广大临床微生物学家关注。通过修改益生菌的基因达到更好的治疗效果，如表达N⁃酰基磷脂甲醇胺（N⁃acylphospha⁃tidylethanolamines）的大肠杆菌Nissle 1917基因工程益生菌小鼠，喂养高脂饮食时，相对于对照组可以减轻肥胖症、胰岛素耐受和脂肪肝的形成［38］。

3.2 微生物组的检验需求

2014年，Dominianni C等［39］进行微生物组分析时对粪便样本的收集方法进行了研究。3个健康人的粪便样本分4种采集方法进行了采集。一是采用便隐血检测试剂卡，在室温保存；二是放入Eppen⁃dorf管保存，在室温保存；三是室温下放入带有RNAlate的Eppendorf管；四是样品立即冻结在-80℃作为对照。所有样本均在各自处理方式下保存3 d，后经16S rDNA基因测序。全面比较不同样本处理方法的微生物类群分布和主要微生物类群的相对丰度，显示低成本的便隐血检测试剂卡可以做为粪便样本可靠的采集方法。

样本处理阶段也可能产生附加DNA污染，分子生物学级别的实验用水、PCR试剂和DNA提取试剂盒均是潜在的污染源。常见的污染微生物包括不动杆菌属、产碱杆菌、芽孢杆菌、军团菌、新鞘脂菌属、假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鞘氨醇单胞菌、草螺菌属、短根瘤菌属、中间根瘤菌属、甲基杆菌、雷弗森菌、青枯菌属、假平胞菌属、狭长平胞菌［40⁃41］。

德国临床微生物学家Hiergeist A等［42］在世界卫生组织临床实验室质量保证和标准化合作中心的帮助下，2014至2015年组织了9家来自奥地利、德国和挪威的实验室进行了基于16S rDNA的粪便微生物组分析的室间质量评估。评估了包括标本采集、DNA的提取和纯化、PCR扩增纯化或浓缩、测序和生物信息学等多个过程。结果显示不同实验室之间在不同微生物类别DNA含量、不同微生物类别丰度、鉴定的菌株数量等方面均存在很大的差异。如不同微生物类别丰度在不同实验室差别极大，厚壁菌门最高丰度78.14%，最低仅为45.98%；拟杆菌门最高丰度44.36%，最低仅为0.96%；放线菌属最高丰度19.42%，最低仅为0.43%；变形菌门最高丰度2.5%，最低仅为0.27%［42］。

2015年3月，在欧洲卢森堡首都卢森堡市举行的第五届国际人类微生物组联盟（internaltional hu⁃man microbiome congress，IHMC）学术会议上，就如何对临床样品收集、DNA提取、储存和转运等问题进行了探讨。Thomas V教授指出建立全过程的标准化操作规程（standard operating procedure，SOP）至关重要。尤其是样本采集和保存方法，将直接影响测序结果和数据分析。实验室必须要确保每份研究样品的合格有效。Sinha R教授通过开展微生物组质控项目（Microbiome QC，MBQC），依据不同实验室的不同研究者在进行试验（湿库）和数据分析结果（干库）所产生的差异，整理和评估不同的实验方法和分析方法对实验结果的影响。显示，湿库的差异比干库造成的偏差更大，但对于单个样品来说，这些差异并没有影响数据的有效性［43］。

4 前景展望

人类微生物组学研究作为新兴的发展方向，其在理论上和临床应用上还有许多方面有待进一步深入。在人类健康与微生物的关系方面，不同群系微生物，在不同部位，对不同疾病，不同种族人群，不同年龄、性别人群的影响的科学解析，是否可以归纳出针对不同疾病的参考微生物群系的诊断图谱或参数？在微生物组研究技术方面，强大的基因测序技术已经生成巨大的数据库，如何采用新型的信息学技术挖掘？需要对其功能进行研究，特别是对大量基因功能信息的获得、针对性基因的研究和新型微生物菌株的鉴定方面需要新的理论和算法作为支撑。在临床应用上，迫切需要解决不同实验室的相互比较的可行性。在样本的采集、运输、储存，检验过程的方法选择、性能评估，以及结果的输出和临床的应用上，均要取得业界的共识，形成一系列的SOP文本。为了保证结果的室间一致性，组织国际间或国内的室间质评计划显得十分必要。

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