肝细胞癌(HCC)对索拉非尼耐药相关机制的研究进展

胡倍源(综述) 覃 伟 董琼珠 钦伦秀,,3(审校)

(1复旦大学附属华山医院普外科 上海 200040;2复旦大学生物医学研究院 上海 200032;3复旦大学肿瘤转移研究所 上海 200040)

原发性肝癌是常见的消化系统恶性肿瘤,全球范围内每年新发病例数超过85万,病死人数高达70万,其中一半发生在中国,发病率有逐年上升的趋势,已成为我国恶性肿瘤第二大死因[1]。在所有原发性肝癌中,肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的类型,约占90%[2],具有易复发、转移、死亡率高、预后差等特点。临床上大多数HCC患者明确诊断时已是中、晚期,因而丧失了手术治疗的时机。

索拉非尼作为一种抗肿瘤的新型多靶向性口服药物,通过抑制酪氨酸激酶受体(如VEGFR、PDGFR、c-Kit和RET)和下游的 Raf 丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine kinase)活性,从而发挥抑制肿瘤血管生成和促进肿瘤细胞凋亡等方面的作用[3]。Ⅲ期临床试验 SHARP和Oriental研究证实,索拉非尼(sorafenib)可以延长晚期肝癌患者生存期,并且在不同的国家地区、不同的肝病状态被证明有明确的生存获益,成为进展期HCC的标准一线疗法。然而,HCC对其耐药性的出现显著影响疗效。耐药可分为原发性(HCC原本就对索拉非尼缺乏敏感性)和获得性(开始敏感,治疗过程中出现耐药)两类,但其机制尚不清楚且不尽相同。因而,进一步探讨HCC对索拉非尼的耐药机制具有一定的临床价值。

索拉非尼耐药相关信号通路目前,比较公认的参与索拉非尼耐药的信号通路包括PI3K/Akt、JAK/STAT和Ras/Raf/MEK/ERK。有研究发现HCC细胞可通过上调EGFR及其配体引起下游通路Ras/Raf/MEK/ERK的持续活化,从而诱导索拉非尼原发性耐药的产生[4-5]。PI3K/Akt及JAK/STAT等通路与肝癌的继发性耐药有关[6-7]。

Rudalska等[8]利用一种能够直接在活体小鼠肝癌组织中进行shRNA筛选的系统(RNAi扫描)来鉴定可能参与肝癌耐药的相关基因:敲除Mapk14(p38a)基因抑制了Mapk14依赖的MEK-ERK和Atf2信号通路的激活,进而增强索拉非尼对小鼠HCC的疗效并延长了小鼠生存时间。与上述研究结果一致的是,Mapk14-Atf2信号通路的激活与接受索拉非尼治疗的肝癌患者临床疗效欠佳密切相关。应用Mapk14抑制剂可明显改善肝癌患者对索拉非尼治疗的敏感性,提高疗效。Rui等[9]研究发现HCC细胞可通过分泌GRP78激活EGFR/SRC/STAT3信号通路,增强HCC细胞对索拉非尼的耐受性。Tomonari等[10]通过对比肝癌耐药细胞与亲代敏感细胞的膜表面蛋白表达差异,发现多重耐药转运蛋白MRP3的表达水平显著升高,而经典的耐药相关信号转导蛋白(如Akt/pAkt、mTOR/pmTOR和ERK/pERK)的量未出现明显变化;敲除MRP3基因后,可恢复肝癌细胞对索拉非尼的敏感性。有研究表明,NUPR1通过激活下游RELB/IER3/RUNX2通路促进HCC细胞的生长、侵袭和增强其对索拉非尼的耐药性[11]。MDIG可以通过抑制H3K9me3/p21的表达促进肝癌细胞的增殖及降低其对索拉非尼的敏感性[12]。FGF19及其受体FGFR4过表达能减少活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生和抑制细胞凋亡,从而导致肝癌细胞耐药的发生[13]。由于肝癌细胞产生对索拉非尼耐药性的机制复杂,单独使用针对某一耐药靶点的抑制剂往往疗效甚微,而使用联合方案又会带来的巨大毒性作用和不良反应,故目前急需研发针对多耐药靶点的抑制剂。

肝癌细胞自身改变对耐药的影响

自噬 自噬被认为是细胞的一种防御和应激调控机制,参与消除、降解和消化一些受损、变性、衰老及失去功能的细胞、细胞器和变性蛋白质、核酸等生物大分子的过程[14]。He等[15]研究发现miR-21可通过激活Akt/PTEN通路,抑制肝癌细胞的自噬发生和促使肝癌细胞对索拉非尼产生耐药。Wu等[16]也发现肝癌细胞可通过ADRB2介导的Akt依赖途径破坏Beclin1/VPS34/Atg14复合体形成,抑制自噬的发生和诱导缺氧诱导因子1α (hypoxia inducible factor 1α,HIF1α)的表达,进而对HCC细胞进行糖代谢重编程和诱导索拉非尼耐药性的产生。然而,Luo等[17]发现,PSMD10可通过促进肝癌细胞发生自噬,进而诱导肝癌细胞对索拉非尼或常规化疗药物产生耐药。上述实验结果提示,自噬在诱导肝癌细胞对索拉非尼耐药过程中扮演着双重角色,可能在肿瘤不同的进展阶段发挥着不同的作用,也可能是由于不同受体激活下游不同通路导致自噬的促进或抑制,但具体选择机制仍需进一步研究加以证实。

上皮-间质转化 上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)概念于20世纪80年代早期由Elizabeth Hay提出[18],她观察到在鸡胚原条中上皮细胞向间充质细胞表型转化。在EMT期间,上皮细胞失去相互连接和细胞极性,重组细胞骨架,改变细胞形态以及重编程某些基因表达。这种改变增强了细胞的运动能力,促进了侵袭表型的转变[19]。EMT被普遍认为与肿瘤的侵袭转移关系密切,亦有文章表明其与肺癌[20]、胰腺癌[21]、乳腺癌[22]等耐药有关。近期有学者指出EMT在肝细胞癌耐药中亦扮演着重要的角色。Xia等[23]通过比较复发和非复发HCC患者组织样本中的microRNA表达情况,发现miR-216a/217的表达水平与EMT程度密切相关。过表达miR-216a/217的肝癌细胞通过减少靶基因PTEN和SMAD7的表达,激活了PI3K/Akt和TGF-β信号通路,从而促使肝癌细胞耐药的发生和肝癌复发。此外,Zhang等[24]发现Gal-1可通过激活PI3K/Akt通路,诱导HCC细胞发生EMT;相关临床数据也表明,Gal-1的高表达与HCC不良预后及肝癌细胞耐药密切相关。Chen等[25]发现血管生成素样蛋白1(angiopoietin-like 1,ANGPTL1)可以阻断MET受体-AKT/ERK-Egr-1-Slug信号通路,抑制肝癌细胞EMT及干性的表达,从而增加耐药细胞对索拉非尼的敏感性,这一结果也间接提示EMT在肝癌对索拉非尼耐药中发挥着重要作用。

铁死亡 与传统意义上的细胞凋亡和坏死不同,铁死亡(ferroptosis)是由铁依赖性脂质过氧化物的过度积累而导致的细胞死亡形式。在细胞内,铁参与线粒体中发生的氧化磷酸化过程,该过程产生ATP的同时也伴随ROS的产生。当ROS水平超过细胞抗氧化能力时可导致氧化应激反应,直接和间接损害细胞内大分子物质(如蛋白质、核酸和脂质),进而导致细胞损伤或死亡[26]。最近,一项研究显示HCC细胞可通过增加金属硫蛋白的生成,减少谷胱甘肽生成和削弱脂质过氧化作用,抑制索拉非尼引起的铁死亡,进而导致肝癌细胞耐药[27]。这一新的发现可能为肝癌细胞的耐药机制研究开辟新的方向。

肿瘤起始细胞 肿瘤起始细胞(tumor-initiating cells,T-ICs)是一群具有自我更新、多向分化潜能,且能启动和重建肿瘤组织表型能力的癌细胞。大量研究均表明,T-ICs参与了肿瘤的转移、复发和对放化疗的耐受。Lo等[28]研究发现耐药细胞株中T-ICs的比例较敏感株显著增加。Tovar等[29]同样证实了耐药细胞中T-ICs的比例增加,除此之外,他们还筛选出敏感株和耐药株的差异表达基因。其中,胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)与纤维母细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)上调最为显著,其下游Akt通路被激活后均可增强肿瘤细胞的干性和对索拉非尼产生耐药。另有研究表明,C8orf可抑制NOTCH2信号通路,进而减弱肝癌起始细胞的自我更新能力和增强索拉非尼的敏感性[30]。目前关于T-ICs的定义还颇具争议,用于分选肝癌起始细胞的表面标志物尚未明确,故现有治疗都无法针对肿瘤干细胞进行杀伤,这些问题都将是未来研究的方向。

肿瘤微环境对肝癌耐药影响

肿瘤相关基质细胞 肿瘤与环境,两者既相互依存、相互促进,又相互拮抗、相互斗争。目前认为肿瘤微环境与肿瘤的发生、发展、转移、耐药等有着密切联系[31]。Chen等[32]发现在索拉非尼治疗后,肿瘤内缺氧增加,由缺氧诱导的基质细胞衍生因子1α(stromal cell derived factor-1α,SDF1α)表达上调,通过趋化因子SDF1α/CXCR4轴,HCC细胞可募集骨髓细胞,促进血管生成,还能直接调节EMT表型转化,引起耐药;另外还发现缺氧促进免疫抑制,瘤内CD8+T淋巴细胞浸润减少,程序性死亡配体1表达增加,调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)及M2型巨噬细胞数量增加,因此作者尝试了PD-L1抑制剂、CXCR4抑制剂与索拉非尼联用,取得了不错的治疗效果。Amalia等[33]发现层粘连蛋白(Ln)-332,一种由肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)产生的异源三聚体糖基化蛋白,与肝癌细胞表面配体α3β1整合蛋白结合后,引起下游被索拉非尼泛素化的FAK发生磷酸化,进而引发耐药。Zhou等[34]观察到对患者和小鼠肿瘤模型使用索拉非尼治疗后,其肿瘤相关中性粒细胞(tumor-associated neutrophils,TAN)显著增多,伴随CCL2 和 CCL17表达升高,使巨噬细胞以及Treg的迁移活性增加;随后证实索拉非尼引起的缺氧可以通过HCC细胞的HIF1α/NF-κB/CXCL5通路募集TAN,TAN分泌细胞因子CCL2和CCL17,分别与巨噬细胞上的受体CCR2 以及Treg上的受体CCR4结合,募集巨噬细胞和Treg到HCC细胞周围以促进其生长、进展和对索拉非尼耐受。

外泌体 外泌体(exosome)是细胞衍生的囊泡,可能存在于所有生物液体中,包括唾液、尿液、血液、腹水和脑脊髓液,体液如血清和血浆等,以及细胞培养物的培养基。外泌体直径在30～100 nm,密度范围在1.13～1.19 g/mL[35],成分复杂多变,如mRNA、microRNA、DNA、热休克蛋白、酶、MHC受体、四糖蛋白、脂筏、细胞骨架元素及膜转运蛋白等[36]。目前在乳腺癌、神经母细胞瘤、肾癌、卵巢癌中均有外泌体参与肿瘤耐药过程的报道[37-40]。在肝癌方面,Zhen等[41]发现来自高侵袭性肝癌细胞的外泌体比来自低侵袭性肝癌细胞的外泌体有更强的效力,高侵袭性肝癌细胞外泌体激活了敏感细胞HGF/c-Met/Akt 信号通路,导致细胞凋亡被抑制,进而使敏感细胞对索拉非尼敏感性降低。外泌体作为近年研究的热点,与肝癌耐药方面的研究非常少,这与肝癌耐药细胞诱导难度大、细胞外泌体分泌量少密切相关。随着外泌体试剂盒的改进与诱导方法的改良,这一瓶颈可能会得到突破。

肿瘤血管选定 血管选定这一现象最早由Holash等[42]在神经胶质瘤中证实,肿瘤在早期阶段利用组织中现有血管促进自身的生长。而Kuczynski等[43]首次发现肝癌最初只依赖于自己生成的血管,但随着索拉非尼治疗的开始,肝癌细胞可以通过“劫持”附近肝组织的正常血管为自己提供血供,从而避开了索拉非尼对血管生成的抑制。此外他们还发现,血管选定过程是可逆的。在停用索拉非尼后,肝癌组织会重新使用自己生成的血管,而这个现象为解释“耐药后停药一段时间,肿瘤可再次对原抗血管生成药物产生反应”提供了一种可能。miRNA测序和功能成像提示在血管选定期间肿瘤出现了EMT,说明肿瘤细胞的迁徙促使了这一现象发生,抑制肿瘤细胞的迁徙或许能为抗肿瘤耐药提供一个新的选择。

结语索拉非尼的原发性耐药和获得性耐药的机制不尽相同,涉及多分子、多通路。尽管目前已从肿瘤细胞和肿瘤微环境水平探讨了影响索拉非尼的耐药因素及其相应机制,但大多数实验局限在细胞和动物模型水平,其实验结果能否外推到人体仍有待进一步证实。近期,一些新技术的出现(如细胞的3D打印技术和类器官培养技术等)将有助于我们更好地利用疾病模型或者药物筛选平台开展研究。此外,液体活检技术的进步可以更准确地识别索拉非尼敏感性分子标志物,筛选索拉非尼最大获益人群,也可预测索拉非尼耐药出现的风险与时间节点,有利于寻找针对性干预和逆转的新策略,指导临床精准用药,提高疗效。同时,随着休眠肿瘤细胞等概念的提出,以及胃肠菌群参与肿瘤耐药过程的发现,其必定会进一步明确肝癌耐药的相关机制。