手足口病患儿心肌酶等血清指标的分析

王　喆，张　倩，黎曼侬，黎　丽，李季梅，张　凤

(1.昆明市妇幼保健院检验科；2.儿科，云南 昆明 650031)

手足口病(hand-foot-and-mouth disease，HFMD)是临床上发病率较高的传染性疾病，近年来虽然相关卫生条件有所改善，但HFMD的发病率仍然可达0.6%以上[1]，近3年来呈现出了明显上升的趋势，且在部分地区容易呈现暴发流行，严重影响了小儿的生命健康。长期的HFMD疾病的进展可导致心肌炎、心内膜炎、肺水肿以及脑膜炎的发生，预后不佳[2-3]。

心脏以及脑部神经组织是HFMD较为常见的累及器官或者组织，对于心脑等重要器官的损伤是增加HFMD患儿后遗症发生的主要因素。在HFMD发病的早期通过检测血清学分子标志物或者其他辅助检查方法，可以为早期糖皮质激素、神经营养性药物的及时临床干预提供参考，从而降低远期神经系统等并发症的发生，改善预后。α-羟基丁酸脱氢酶(α-hydroxybutyrate dehydrogenase，α-HBDH)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase mulscle brain，CK-MB)等是评估心肌细胞损伤的重要标志[4]，而为神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、酸性钙结合蛋白S100(S-100β)是评估神经系统损伤和受累的重要标志[5]，本次研究重在探讨相关血清学指标在不同程度的HFMD患者中的异常表达，进而为早期诊断HFMD患者的心脏以及脑部神经组织的损伤提供重要参考。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2016年1月至2016年3月在昆明市妇幼保健院治疗的手足口病患儿179例，其中21例为危重型患儿，89例为重型患儿，69例为普通型患儿，同时选取本院门诊健康体检儿童30例(对照组)，纳入标准：①手足口病诊断符合卫生部2010年版《手足口病诊疗指南》[6]；②患儿家属知情同意并签署同意书。排除标准：①近3个月有上呼吸道感染或手术史；②合并有神经系统疾病。

1.2标本采集及检测方法

患者于入院当时采肘静脉血，2mL血样在室温下静置30分钟后，4 000r/min离心10分钟分离血清，并将血清置于4℃摇床上，避免溶血的发生，将血清置于Eppendorf管中，-80℃超低温冰箱保存，避免反复冻融，为减小批间误差和测量误差，全部标本采集完成后一次性成批检测LDH、α-HBDH、CK和CK-MB水平。放射免疫试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司，生化检测仪器Olmypus 640购自上海精密仪器有限公司。

CTnI的检测采用化学发光法检测，采肘静脉血2mL血样在室温下静置30分钟后，4 000r/min离心10分钟分离血清，Beckman counter DXI80 仪器购自上海精密仪器有限公司。

采肘静脉血2mL血样在室温下静置30分钟后，4 000r/min离心10分钟分离血清，4℃保存待测，以标准品稀释液将标准品复溶，静置15min后混匀，对比稀释为7个浓度，取出板条，除了对照孔外每个孔加入不同浓度的标准品，剂量为100μL/孔，采用封板盖封住，室温反应120分钟，使用PBS液体洗涤3次，除了空白对照孔，每孔加入检测液(100μL)，室温孵育1小时，PBS洗涤3次，加入底物(50μL/孔)，避光孵育25分钟，加入终止液5分钟后测定450nm处吸光度。酶标仪科华KBH ST-300购自上海精密试验仪器有限公司，NSE、S-100抗体购自南京凯基生物科技有限公司，配套试剂购自罗氏检测公司，严格按照说明书的要求进行操作。

1.3统计学方法

数据处理分析应采用SPSS 19.0统计软件，计量资料采用(χ±S)表示，组间比较使用方差分析，两两比较使用LSD检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2结果

2.1患儿基本情况

各组患儿一般临床资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1各组患儿一般临床资料比较[χ±S，n(%)]

Table 1 Comparison of general clinical data of children among groups[χ±S，n(%)]

组别例数(n)年龄(y)男/女危重型212．32±0．8113(61．90)/8(38．10)重型892．40±0．7551(57．30)/38(42．70)普通型692．37±0．9442(60．87)/27(39．13)对照组302．41±0．8819(63．33)/11(36．67)F/χ22．1810．458P>0．05>0．05

2.2各组血清心肌酶及心肌肌钙蛋白Ⅰ比较

手足口病患儿血清LDH、α-HBDH、CK和CK-MB明显高于对照组，而CTnI明显低于对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)；危重型手足口病患儿血清LDH、α-HBDH、CK和CK-MB分别为(402.13±34.29)IU/L、(312.37±61.92)IU/L、(154.20±17.82)IU/L和(27.83±9.04)IU/L，均明显高于重型和普通型患儿，而CTnI为(0.11±0.02)IU/L，明显低于重型和普通型患儿，差异均具有统计学意义(具P<0.05)，见表2。

表2　　各组血清心肌酶及CTnI比较(χ±S)

注：a与对照组比较P<0.05；b与普通型比较P<0.05；c与重型比较P<0.05。

2.3各组血清神经元特异性烯醇化酶含量比较

危重型和重型手足口病患儿NSE为(27.10±6.52)ng/mL和(19.43±6.10)ng/mL，均高于普通型患儿和对照组，差异均具有统计学意义(均P<0.05)；危重型患儿NSE水平高于重型患儿，差异具有统计学意义(P<0.05)；普通型和对照组NSE比较差异无统计学意义(均P>0.05)，见表3。

表3各组血清NSE含量比较(ng/mL，χ±S)

Table 3Comparison of serum NSE levels among groups (ng/mL，χ±S)

组别例数(n)NSEFP危重型2127．10±6．52abc重型8919．43±6．10ab32．104<0．05普通型6911．20±3．22对照组3010．53±2．81

注：a与对照组比较P<0.05；b与普通型比较P<0.05；c与重型比较P<0.05。

2.4各组血清S-100蛋白水平比较

表4各组血清S-100含量比较(pg/mL，χ±S)

Table 4Comparison of the content of serum S-100β among groups(pg/mL，χ±S)

组别例数(n)S⁃100bFP危重型21730．14±42．19abc重型89420．11±32．27ab54．291<0．05普通型69314．20±45．58对照组30302．82±56．73

注：a与对照组比较P<0.05；b与普通型比较P<0.05；c与重型比较P<0.05。

3讨论

3.1手足口病患儿心肌损伤及神经系统累及的血清标志物研究背景

HFMD主要发生在5岁以下的儿童，潜伏期多为2～10天，平均3～5天，多数HFMD急性起病，发热、口痛、厌食、口腔黏膜出现散在疱疹或溃疡，位于舌、颊黏膜及硬额等处为多。严重的HFMD患儿在发病1～5天出现脑膜炎、脑炎(以脑干脑炎最为凶险)、脑脊髓炎、肺水肿、循环障碍等，少数病例病情危重，可致患儿死亡。HFMD导致的患儿脑部及心脏的损伤，是HFMD的主要病因。然而迄今为止临床上对于HFMD发病早期的心脏及脑组织损伤的诊断缺乏有效依据，血清学Cox A16、EV 71等抗原检测耗时较长，费用较高，多在HFMD发病6～7d以后才逐渐上升[7]，且Cox A16、EV 71等抗原水平检测并不能提示HFMD脑组织及心肌细胞损伤程度[8-9]。LDH、α-HBDH、CK和CK-MB等是评估心肌细胞损伤的重要标志，在正常人群中由于心肌细胞膜完整而难以进入循环血中，而HFMD由于肠道病毒对于心肌及脑组织的损伤，进而导致细胞膜的破裂，细胞内的LDH、α-HBDH、CK和CK-MB释放入血，导致外周血中的相关指标显著上升。但迄今为止对于相关指标的研究仅仅限于心肌梗死患者，而对于HFMD患儿特别是年龄小于3岁的患者，相关心肌损伤指标的生物学标记作用研究不足；NSE主要存在于中枢神经系统组织中，可以通过促进α-磷酸甘油转化为磷酸烯醇丙酮酸，在神经元细胞损伤后，细胞内的NSE透过血脑屏障进行循环血中，进而导致外周血中的NSE的上升[10-11]；S-100蛋白作为神经元标志性酸性蛋白，主要存在于角质细胞和施万细胞中，对于中枢神经系统损伤具有重要的标志作用[12-13]，虽然相关研究探讨了S-100及NSE在HFMD中的异常表达，但对于S-100和NSE与不同病情严重程度的HFMD的关系的探讨不足。本次研究的创新性在于首次综合性分析了5种肌损伤指标在HFMD中的表达，并通过患儿的皮肤黏膜损伤、心脑损伤等进行分级，进而进一步探讨S-100和NSE对于早期评估心脑损伤的价值。

3.2心肌酶谱、肌钙蛋白I等对于手足口病心脏损伤的评估价值

本次研究发现，LDH、α-HBDH、CK和CK-MB在HFMD患者体内明显高于正常对照组，虽然上升的幅度不一，但多数指标可上升50%以上，其中LDH可上升至402.13±34.29IU/L，而CK-MB可上升至27.83±9.04IU/L，相关心肌细胞损伤指标的上升提示在HFMD发病早期通过检测血清中LDH、α-HBDH等可以为早期诊断以及临床干预提供参考。但有趣的是，虽然CTnI也作为心肌损伤指标，但在重型及危重型HFMD患者血清中显著下降，其中危重型患儿的血清CTnI仅为0.11±0.02IU/L，明显低于正常对照人群，这与Tan等[8]研究者报道的CTnI平均上升30%～45%数据不符，其主要考虑主要与危重患儿的损伤主要表现为神经系统的受累，虽然心肌细胞存在一定的损伤，但鉴于本次研究中ELISA检测患儿血清相关指标的时间在发病8h以后，半衰期较短，多数可能已经肾脏的排泄和肝脏的代谢，故表现为CTnI的下降，但仍然需要进一步研究和探讨。

3.3神经元特异性烯醇化酶和S-100蛋白在评估手足口病患儿神经系统损伤中的价值

NSE参与脑神经元细胞的磷酸甘油的代谢，并对于神经元损伤具有特异性的标志作用，本次研究中HFMD患儿的血清NSE明显高于正常对照人群，且病情越重，患儿的血清NSE的表达越高，其中危重型和重型手足口病患儿NSE可达20ng/mL左右，表明NSE可以作为早期诊断HFMD的潜在指标，同时通过动态检测血清NSE的表达能够为评估HFMD的脑神经元损伤程度提供参考。Isgro等[14]和陈迪等[15]学者通过分析了43例重型HFMD患儿的血清NSE资料，发现NSE可平均上升45%以上，且NSE大于25ng/mL时，患儿发生脑膜炎及脑干脑炎的几率可上升5%以上，预后不佳。S-100蛋白是一种反映中枢神经系统损伤的特异性物质，通过对于神经元细胞膜上的磷脂羟基末端的修饰作用，进而参与神经元细胞的相关生理性代谢，S-100蛋白的上升往往提示神经元细胞膜的损伤，本次研究中危重型和重型HFMD患儿血清中的S-100均明显高于正常对照人群，且危重组患儿的指标上升更为明显，提示S-100蛋白是评估HFMD患儿脑组织损伤的重要指标，可以在一定程度上反映患儿的脑损伤程度。

3.4总结与展望

综上所述，血清心肌酶及心肌肌钙蛋白的检测能尽早发现手足口病患儿心肌损害，从而有利于早期临床干预进而改善预后，NSE和S-100蛋白在危重型和重型手足口病患儿中明显增高，与病情的严重程度有关，临床上通过检测血清中的NSE或者S-100蛋白水平的表达，能够为评估脑组织损伤提供参考。但需要注意的是本次研究中的CTnI表达下调与相关研究不符，希望后续研究可以在HFMD患儿发病后的不同时期进行检测，进而进一步探讨CTnI的诊断或者预后随访价值。

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