银杏无菌苗培养方法的优化

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(扬州大学园艺与植物保护学院，　江苏 扬州 225009)

银杏(GinkgobilobaL.)为银杏科银杏属的落叶乔木，具有极高的药用、食用和观赏等价值。比如，银杏的种子中含有多种营养物质，包括蛋白质、脂肪、钙、磷、铁、胡萝卜素等，还含有内酯、胆固醇、聚戊醇等有效成分，对于心脑血管疾病具有良好的疗效[1]。近年来，银杏叶因含有黄酮和萜内酯等有效成分而受到关注，其提取物对消除自由基、抗肿瘤、抗氧化及保护神经系统有着重要的作用[2]。此外，由于银杏栽培管理方便，寿命长，观赏性能好，已经成为城市园林绿化的主要树种。银杏的繁殖可通过播种、嫁接、扦插以及组织培养等方式。随着银杏的发开和利用，对于银杏的需求量日渐增大，而植物组织培养可快速繁殖优质种苗。因此，加强银杏组织培养技术的研究，对促进银杏无性系育种，工业化生产银杏次生代谢产物以及银杏研究具有重要意义。

银杏组织培养开始于20世纪30年代[3]，主要以银杏的营养器官、花粉、配子体等为材料进行培养[4-11]。如Choi等[9]对银杏的未成熟胚进行了研究，Tommasi等[10]用银杏叶进行了组织培养，陈颖[8]等用银杏无菌苗各部位茎段为外植体，研究其不同位置的茎段芽萌发和不定芽的分化情况。然而前人的研究大多直接使用灭菌后的银杏器官进行培养，容易造成组织培养过程中的污染，组织培养的成功率较低。此外，银杏组织培养目前还没有一个高效的快繁体系。为了获取无菌材料，更好的用于后期组织培养，本研究分别以银杏种核和种胚为试验材料，研究不同外植体、培养基和胚乳汁对银杏无菌苗生长的影响，筛选适合银杏无菌苗生长的培养基配方，为进一步进行银杏组织培养提供技术支持。

1　材料与方法

1.1　实验材料

银杏种子在2016年10月23日于扬州大学银杏资源圃(32°39′E，119°42′N)采集。银杏种子外种皮不经腐熟直接去掉，流水洗净晾干后常温贮藏。2017年1月，以除去中种皮的银杏种子、种胚进行接种。

1.2　实验方法

1.2.1材料处理

将银杏种子去除中种皮后，在无菌条件下，经75%的酒精浸泡5 min，17%次氯酸钠消毒20 min，用无菌水冲洗3次，然后用无菌的滤纸吸去材料表面的水分。银杏种胚用解剖刀将种子从脊部切开，将种胚取出。

1.2.2培养基成分

以WPM、MS为基本培养基，分别在WPM培养基中添加35 g蔗糖和7 g琼脂，MS培养基中添加35 g蔗糖和7.5 g琼脂，并附加1%、3%、5%等3种不同浓度的银杏胚乳汁液。培养基pH值为5.6～5.8。详细配比如下：

1) 木本专用培养基+1%胚乳提取液(成熟胚)；

2) 木本专用培养基+3%胚乳提取液(成熟胚)；

3) 木本专用培养基+5%胚乳提取液(成熟胚)；

4) 木本专用培养基(成熟胚)；

5) MS+3%胚乳提取液(成熟胚)；

6) 木本专用培养基(种核)。

表1不同接种材料的无菌苗生长情况

接种材料污染率(%)发芽率(%)芽苗高度(cm)叶片数(片)生根率(%)平均生根数(条)主根长侧根率(%)种核84．0012．507．8512．500．137．20．00成熟胚2．0072．001．7742．05696．0016．0234．00

表2不同胚乳汁浓度下无菌苗的生长情况

胚乳汁浓度(%)污染率(%)发芽率(%)芽苗高度(cm)叶片数(片)生根率(%)平均生根数(条)主根长侧根率(%)02．0072．001．7742．05696．0016．0234．00132．0041．181．1182．07188．240．913．252．94338．0096．771．9613．23396．771．357．9226．67528．0091．671．5783．06197．221．496．4225．00

1.2.3培养条件及指标测定

银杏无菌苗培养温度为(25±2)℃，光照强度为2 000～3 000 lx，16 h光照，8 h黑暗。培养60 d后对污染率、发芽率、芽苗高度、平均叶片数、生根率、平均生根数及主根长进行测定。在结果统计中所涉及的测定项目计算公式如下：

污染率(%)=污染的外植体数/接种的外植体数×100%；

发芽率(%)=发芽的外植体/接种的外植体数×100%；

平均叶片数=每处理叶片的总数/发芽的无菌苗数；

生根率(%)=生根的外植体/接种的外植体数×100%；

侧根率(%)=产生侧根的外植体/接种的外植体数×100%；

平均生根数=每处理生根的总数/生根的无菌苗数；

主根长=每处理主根的总长度/生根的无菌苗数。

2　结果与分析

2.1　不同接种材料无菌苗生长情况的影响

首先对试验材料进行筛选，分别以发育成熟并完成生理后熟的银杏种核和分离出的成熟种胚为材料，接种到WPM培养基中。结果表明，接种材料对无菌苗的生长情况影响显著。以种胚为接种材料(图1-a至1-c)的污染率仅为2%，显著低于以种核为接种材料(图1-d至1-f)的无菌苗的污染率(高达84%)。此外，以种胚为接种材料，其发芽率和生根率，分别达到72.00%和96.00%，均远高于种核并且种胚所长成的无菌苗有部分出现侧根，而以种核为接种材料的无菌苗则没有侧根。以种胚为接种材料，其无菌苗(图1-b)萌发出芽的时间明显早于种核(图1-e)，但生长速率较慢。在无菌苗生长60 d时，以种胚为接种材料的无菌苗，其芽苗高度和平均叶片数目要显著低于种核长成的无菌苗。综上所述，银杏无菌苗的接种材料以成熟胚的效果最佳，污染率低，发芽率及生根率均较高，无菌苗萌发出芽时间较早，但其生长速度较慢。

2.2　胚乳汁对无菌苗生长情况的影响

为了提高以种胚为接种材料的无菌苗的生长速率，将银杏胚乳榨汁后加入WPM培养基中，并设置0%，1%，3%和5%共4种胚乳汁的浓度梯度(表2)。结果表明，在培养至29 d时，添加了1%胚乳汁的培养基中无菌苗生长速度最慢(图1-g)，而添加3%胚乳汁的培养基中无菌苗生长速度最快(图1-h)，其次为添加5%胚乳汁浓度下的无菌苗的生长速度(图1-i)。结果表明，加入1%胚乳汁(图1-j)的发芽率显著低于其他处理，而加入3%(图1-k)和5%(图1-l)胚乳汁的无菌苗发芽率和生根率均高于其他处理，达到90%以上。然而，与对照相比，加入胚乳汁的培养基污染率均较高，分别为32%，38%和28%，而对照(图1-f)的污染率仅为2%。此外，加入3%和5%胚乳汁的无菌苗叶片数略多于其他处理，平均到达3片/株，侧根生长情况也较好(图1-m至1-n)，侧根率分别为26.67%和25%。尤其3%胚乳汁的芽苗高度最高，主根长度最长，分别达到1.961 cm和7.92 cm。而添加5%的胚乳汁对于银杏无菌苗生长高度具有一定的抑制，为1.578 cm。综上分析表明，胚乳汁显著影响了银杏无菌苗的生长，且以添加3%胚乳汁效果最佳。

2.3　不同培养基对无菌苗生长情况的影响

在明确了最佳接种材料和胚乳汁添加浓度的基础上，进一步筛选最佳培养基。以分离出的银杏种胚为接种材料，分别采用MS和WPM 2种培养基，并添加3%胚乳汁(表3)。不同培养基的实验结果显示，WPM培养基中无菌苗(图1-k)的发芽率远高于MS培养基(图1-o)，高出约33%。此外，虽然MS培养基中无菌苗的生根率达到81.82%，但是无侧根发生，且芽苗的生长高度较低，为1.24 cm。而WPM培养基生长的无菌苗生根率、发芽率及芽苗高度等均较好，分别达到96.77%，96.77%和1.961 cm，且侧根的发生率也高达26.67%。综上所述，WPM培养基并添加3%胚乳汁更适于以银杏种胚为接种材料的无菌苗的培养。

注：a～c为银杏种胚长成无菌苗(a为接种后1 d；b为接种后29 d；c为接种后60 d)；d～f为银杏种核长成无菌苗(d为接种后1 d；e为接种后29 d；f为接种后60 d)；g～i为1%，3%，5%的胚乳汁浓度下29 d的无菌苗；j～l为1%，3%，5%的胚乳汁浓度下60 d的无菌苗；m～n为3%，5%无菌苗侧根生长情况；o为以MS为基本培养基，附加3%胚乳汁浓度培养基的无菌苗。图1　银杏种子无菌苗的培养

表3不同培养基中无菌苗的生长情况

培养基类型污染率(%)发芽率(%)芽苗高度(cm)叶片数(片)生根率(%)平均生根数(条)主根长侧根率(%)WPM+3%胚乳汁38．0096．771．9613．23396．771．357．9226．67MS+3%胚乳汁78．0063．641．2402．57181．820．824．470．00

3　讨　论

银杏为较为古老的裸子植物，在组织培养过程中易出现褐化、生根难等问题，组织培养的难度较大。陈颖等[8]通过对无菌苗的茎段进行分别培养，建立了银杏组培茎段快繁体系。因此，在银杏的组织培养中，无菌外植体的获得非常重要[12]。但由于银杏种核体积较大，往往灭菌不彻底造成污染，影响无菌苗的培养。本研究发现，将进行灭菌处理后的种核剖开分离出种胚，采用种胚接种后污染率可显著下降。此外，因为银杏受精作用发生迟，受精过程复杂，从而造成了成熟采收后的种子中无胚率较高，一般可达40%～50%，这部分种子即使完成了生理后熟也不能萌发生长成幼苗。因此，采用种胚为接种材料，还可大大提高萌发率和无菌苗的数量。

王伏雄等研究发现，蜂王浆和椰子乳汁对银杏幼胚生长发育有很大影响[13-14]。其中，蜂王浆对于银杏幼胚的器官分化和发育具有明显的促进作用。而椰子乳汁对促进幼胚分化生长的作用也较明显。本研究发现，以银杏种核为接种材料的无菌苗基本都能生根，而以种胚为接种材料的无菌苗生根率则较低。分析二者的差别主要在于种核具有胚乳结构，可在后期种胚萌发过程中提供充足的养分，而分离出的种胚脱离了胚乳组织，有效的养分供应显著减少，因此猜测银杏胚乳对于种胚生根可能具有一定作用。将银杏胚乳榨汁后加入培养基，进行高压消毒，分别设置不同的浓度梯度，发现银杏胚乳汁对于银杏种胚的生长及生根的确产生一定的促进作用，尤其添加3%的胚乳汁后，发芽率，芽苗高度，生根率和侧根发生率均显著提高。

对于银杏的组织培养，前人多采用MS培养基[15-16]、改良MS培养基[16-17]以及White培养基等[18]。本研究主要采用的是WPM培养基，这种培养基为木本植物培养基，是由Lloyd和McCown于1980年开发的一种低浓度的培养基，适合于多种木本植物的培养。以银杏种胚为接种材料，比较MS培养基+3%胚乳汁和WPM培养基+3%胚乳汁，结果表明，WPM培养基加入胚乳汁后，无菌苗的发芽率、芽苗高度、主根和侧根生长情况较高，说明培养基对银杏无菌苗的培养产生影响，筛选出WPM添加3%胚乳汁的最优培养基配方，而MS培养基所适应的胚乳汁浓度依然需要进行进一步的实验明确。

参考文献：

[1]史垠垠.白果饮料加工工艺及稳定性研究[D].南京:南京林业大学,2010.

[2]李保同.银杏叶总黄酮的提取纯化及其抗氧化性能研究[D].北京:北京林业大学,2016.

[3]桂仁意,曹福亮.银杏组织培养研究进展[J].南京林业大学学报(自然科学版),2004,28(3):99-104.

[4]任鹏斌,王阿姣,李波,等.银杏叶片愈伤组织诱导的激素组合培养条件分析[J].湖北农业科学,2016,55(1):216-219.

[5]慕莹,赵晓燕,景丹龙,等.银杏不同组织器官及愈伤组织培养中端粒酶活性测定[J].北京林业大学学报,2014,36(3):95-99.

[6]秦小舒,逯岩,郁万文,等.不同发育阶段银杏胚的组织培养研究[J].北方园艺,2014(23):87-90.

[7]盛丽莉.NaCl和Ce3+对银杏悬浮细胞生长和黄酮代谢的影响[D].南京:南京林业大学,2012.

[8]陈颖,曹福亮,徐彩平,等.不同部位银杏茎段培养及位置效应的研究[J].浙江林业科技,2010,30(1):28-31.

[9]Choi PS,Cho DY,Soh WY.Shoot Organogenesis from Immature Zygotic Embryo Cultures ofGinkgobiloba[J].Biologia Plantarum,2003,47(2):309-312.

[10]Tommasi F,Scaramuzzi F.In vitro,Propagation ofGinkgobiloba,by Using Various Bud Cultures[J].Biologia Plantarum,2004,48(2):297-300.

[11]Phongtongpasuk S,Piemthongkham P.Shikimic Acid Production fromGinkgobilobavia Callus Culture[J].Advanced Materials Research,2014,931:1 524-1 528.

[12]蒋时姣,钟宇,张帆,等.柳杉种子无菌苗组培快繁体系的建立[J].植物生理学报,2014,50(7):1 039-1 044.

[13]王伏雄,陈祖鏗,李宪章.银杏幼胚离体培养的研究Ⅰ.蜂皇浆对幼胚生长的影响[J].Journal of Integrative Plant Biology,1963,11(3):217-224.

[14]王伏雄,陈祖鏗.银杏幼胚离体培养的研究——椰子乳汁对幼胚生长的影响[J].植物学报,1965,13(3):224-239.

[15]陈颖,徐彩平,盛丽莉,等.银杏胚的培养及不定芽的产生[J].广西植物,2011,31(5):679-683.

[16]袁红慧,李琳玲,程华,等.银杏幼胚培养的多因子正交试验研究[J].河南农业科学,2012,41(1):117-121.

[17]王莲辉,邓龙玲,杨方成,等.银杏快速繁殖及脱毒技术研究[J].中国野生植物资源,2003,22(2):53-55.

[18]崔刚,唐蕾,王武.培养基和外源激素对银杏愈伤组织诱导、生长及叶绿素含量的影响[J].食品与生物技术学报,2008,27(2):117-122.