三白草APETALA1基因的克隆和在苞叶中的表达

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(云南农业大学农学与生物技术学院，　昆明 650201)

在一些被子植物类群中，认为花瓣来源于苞片或者叶片的改变(bracteopetaloidy) ,花瓣状苞片象真正花瓣一样行使吸引传粉者的作用,可是，很少研究在花器官之外(如花瓣状的苞片)MADS-box直系同源的作用。拟南芥的直系同源MADS-box基因在花瓣状总苞表达只有在鸽子树[Davidiainvolucrate(Cornales)][1]和山茱萸中研究过[2]，发现基因有异位表达的现象。

A-class功能基因的起源至今仍然是个谜。在真双子叶植物拟南芥中，A功能基因最终演化为APETALA1(AP1),CAULIFLOWER(CAL)和FRUITFULL(FUL)，这3个旁系同源的功能产生了新功能化和亚功能化，分别调控特定组织器官形态，即AP1主要是控制花萼和花瓣发育，由于在ap1突变体中，花萼转变成苞片而花瓣缺失，因此形成的花只有雄蕊和雌雄[3]。同时AP1还控制花分生组织的识别，从柳树中分离出来的SAP1-1和SAP1-2基因通过拟南芥中异源表达SAP1-1基因可以使拟南芥提前开花，并且每一朵花中花瓣多于4个，而从拟南芥分离出来的AP1或者其它同源基因转化拟南芥的结果没有出现这种表型，说明SAP1-1控制花分生组织的识别和花瓣的数目[4]；而从菠菜中分离出来的AP1基因在花萼中没有表达，推测AP1基因在菠菜中的功能是不保守的[5]。

图2　Blastx预测AP1蛋白质保守的功能结构域

三白草在开花时植株顶端3片苞片变白而引人注目，更重要的特点是其花没有花萼和花瓣，是属于无被花，花器官结构非常简单，只由雄蕊和心皮组成，而且花非常小。本实验通过RACE方法克隆三白草的A-ClassAP1基因的cDNA全长；通过RT-PCR研究AP1 MADS-box基因在苞叶变化过程中表达情况。同时对开花时顶端3片苞片变白和三白草花被缺失的原因进行探索，是否也象珙桐(Davidia)和山茱萸(Cornus)中存在基因异位表达的现象。

1　材料与方法

1.1　实验材料

无被花的三白草的幼叶，苞叶变白过程中的一半白叶和一半绿叶，苞叶变白过程中的全部白色苞叶，苞叶退白过程中一半白叶和一半退白的绿叶，所采集的三白草材料栽种在云南农业大学后山实验基地。

1.2　实验仪器

PCR仪、电泳槽、离心机、振荡床、超净工作台、恒温培养箱等。

1.3　RNA的提取

选用Trans Zol Plant(TransGen Biotech，Beijing，code#ET 121-01)提取三白草花器官的RNA，严格按照试剂盒进行。

1.4　特异性引物设计

3’-RACE CDC Primer

5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30 VN-3

AP 1-F 5-ATGGGGAGGGGACGGGT-3

AP 1-R 5-TTTTTAATAACAATGAAAATCATTA-3

1.5　cDNA的合成

5’端RACE按SMART RACE cDNA Amplication Kit操作流程进行。PCR反应按程序进行循环：35的循环；94 ℃×3 min 30 s，94 ℃×20 s,54 ℃×30 s,72 ℃×1 min，72 ℃×7 min,4 ℃×∞，循环结束后，取5μL样品在1%琼脂糖凝胶上电泳，检测合成情况。

1.6　电泳检测，割胶回收目的片段

取5μL的PCR产物进行克隆，克隆方法参照文献[8]，送北京华大基因公司进行测序。

2　结果与分析

2.1　RACE的结果

进行cDNA的反转录合成，得到cDNA片段，将其在NCBI http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi中进行blastx的结果，发现是属于AP1 MADS-box基因家族。为了进一步研究该基因的功能及表达特性，克隆全长序列。以三白草的mRNA为模板，严格按照试剂盒的说明进行全长序列的克隆，以RACE CDC Primer和AP1-F为引物，进行PCR，得到其3’端的序列，其3’端的序列与5’端的序列拼接，然后进一步克隆得到1 076 bpAP1 MADS-box全长cDNA(如图1)，包含有完整的编码框736 bp。

图1　AP1全长基因的克隆

2.2　序列比对

将推测的氨基酸序列在美国国家生物技术信息中心NCBI网站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上进行BLAST搜索，分析表明，其编码的蛋白质与多种植物的AP1蛋白具有很高的同源性。具有保守的MADS-box和K-box结构域，如图2。

图3　AP1基因的序列

图4　AP1蛋白质C末端结构域的比较

2.3　序列分析

通过PCR扩增、转化并测序，从三白草cDNA中获得全长序列。序列分析结果(图3)表明，该基因cDNA 全长1 076 bp，编码框为738 bp，编码245个氨基酸，该基因序列从起始密码子ATG开始，到终止密码TAG终止。

从三白草中分离出来的AcAP1基因推定的氨基酸序列C末端结构域与其他物种AP1基因的氨基酸序列比对结果，显示AP1氨基酸序列的3’端保守性较低，这是MADS-box基因的典型特征，并在C端不存在单子叶植物APl/SQUA基因所特有的paleoAPl(LPPWML)结构域，也不具有与被子植物基部相对保守的MPWWML基序，而是MLAWLL基序，只具有部分保守的M--W-L结构域，如图4。

2.4　AP1基因在花瓣状苞叶中的表达

AP1基因在苞叶颜色变化过程中，苞叶全部变成白色和退白过程中一半是白色的苞叶中表达量最高，如图5中条带4和条带5；而在幼叶中几乎没有表达量，如图5中条带1；在苞叶变白过程中的一半是叶绿色，一半是白色的苞叶以及退白部分的表达量近似，如2,3条带和6条带。所以在全白和退白的这部分白叶片中表达量最高。

图5　AP1基因在苞叶中的表达