热水老化对棉花种子活力及遗传完整性的影响

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(新疆农垦科学院生物技术研究所/兵团作物种质创新与基因资源利用重点实验室，　新疆 石河子 832000)

种子自然成熟后即进入衰老过程，生活力逐渐丧失，这被称为种子的老化。老化是种子贮藏过程中普遍存在的一种现象，是一个伴随着种子贮藏时间的延长而发生和发展的、自然而不可避免的过程[1-2]。种子的老化是不可逆转的。在这个过程中种子会产生劣变，包括种皮变色、质膜透性增加等，影响种子的萌发、幼苗生长，以致于生产中对作物产量产生较大影响。为了保持种质的活力和遗传完整性，世界上作物种质资源约90%以种子的形式保存于低温库中(FAO,1996)。尽管现代低温库贮藏技术可以延长种子寿命，但随着贮存时间的延长种子仍会发生劣变，对种质资源的保存、开发和利用等都产生严重的影响[3-4]。因此，种子老化相关研究一直是人们关注的热点[5]。

种子的老化可以分为自然老化和人工加速老化2种。研究人员采取人工加速老化的方法模拟种质老化过程，在生理生化层面及分子水平上来检测不同品种种子的抗老化能力、研究种质老化的规律。人工加速老化的方法主要有高温高湿法，热水法等方法。目前，高温高湿法在棉花、小麦和花生[3，5-7]等作物种子老化研究中应用比较广泛，对热水加速老化的研究报道很少。高温高湿法处理种子在饱和湿度下容易滴水，造成处理不均匀。另外，长时间高温高湿条件下种子表面往往会发生霉变，影响后续的活力和生化指标等的鉴定[6]。而热水老化不但处理周期相对短，操作方法简便，更为重要的是种子与热水能够充分接触，处理非常均匀，效果比较理想。本研究采用65 ℃热水对3个陆地棉品种(系)加速老化，不同水平的处理后通过检测供试棉花种子的活力指标、电导率及遗传完整性的变化，明确不同棉花种品抗老化能力差异，探索棉花种子老化规律，以期为棉花品种抗老化能力的鉴定和抗老化种质的筛选提供理论依据。

1　材料和方法

1.1　材　料

供试材料为本单位自育的2个早熟陆地棉品系799、223和新陆早36号。供试种子在加速老化处理前统一调整水分至5%，确保老化处理后各项检测结果具备可比性。

1.2　测定方法

1.2.1人工加速老化方法

参照黄瑶等[7]的方法，挑选均匀饱满的棉种装入尼龙网袋，在65 ℃恒温水浴锅中分别设置10，20，30，40，50，60 min和70 min 7个老化时间，于室温下晾干平衡水分，并以不处理种子为对照。

1.2.2种子活力检测方法

大号发芽盒内以蛭石为基质，每处理3个重复，每重复30粒，置于低温强光照培养箱内28 ℃恒温发芽，每天调查发芽数，以第4天发芽的种子数计算发芽势，第7天发芽的种子数计算发芽率和发芽指数。播种后第8天计数，幼苗冲洗干净，晾干表面水分测量株高，计算活力指数。

发芽势(%)=第4天的发芽种子数/播种粒数×100%；

发芽率(%)=第7天发芽种子数/播种粒数×100%；

发芽指数(GI)=∑Gt/Dt；

活力指数(VI)=GI×S。

式中Gt为计数期内第t天的发芽种子数，Dt为不同发芽天数，S为幼苗单株株高。

1.2.3电导率检测方法

每个材料各个处理分别取30粒种子，以10粒为一个重复，称重后剥去种皮，双蒸水冲洗3遍。用干净的滤纸吸干表面水分后分别装入200 mL锥形瓶，加入40 mL双蒸水浸泡24 h，用DDS-12 W微机型电导仪检测25 ℃下浸出液电导值，沸水蒸煮30 min后再次检测电导值，计算相对电导率。

相对电导率(%)=浸出液电导值/蒸煮后电导值×100%。

1.2.4DNA提取方法

参考匡猛等[8]的方法提取棉花基因组DNA。样品研磨稍作改动，将去皮且完整的棉籽放于研钵中，加入少量石英砂快速研磨成粉，加入提取液(提取液组成为：1% SDS，0.01 mol/L EDTA，0.705 mol/L NaCl，0.05 mol/L tris，0.5%山梨醇，1%PVP和 1%-巯基乙醇)，酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)混合液各抽提1次，预冷异丙醇沉淀DNA。75%乙醇洗涤2次，室温下自然晾干后1×TE充分溶解备用。为消除提取过程中产生的误差，每个处理设置3个重复，重复间使用均匀一致的双粒种子。

1.2.5SSR扩增

SSR扩增采用20 L体系：Buffle缓冲液(含1×Mg2+3 mmol/L)，dNTPs 200 mol/L，Taq酶0.05 U/L，引物 0.25 mol/L，DNA模板1 L(浓度为10 ng/L)。扩增程序为：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸 45 s，35个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。4%琼脂糖凝胶检测扩增产物，电极缓冲液为1×TAE，电泳时间为45 min，用Marker 2000作对照。

1.3　数据处理及分析

采用Excel和IBM SPSS Statistics 20软件分别进行数据处理与方差分析。

2　结果与分析

2.1　热水老化对棉花种子发芽势的影响

发芽势反映在一定的时间内种子发芽的整齐度，是衡量种子质量的重要指标之一。农业生产中，种子在大田中短时间内快速整齐的发芽，不仅能为田间的出苗打好基础，也可避开不可预测的例如倒春寒等不良天气的影响。由图1可知，棉花种子在经过65 ℃ 10，20 min和30 min处理后，3个棉花材料的发芽势较对照基本没有显著的变化。从40 min的处理时间开始，所有材料发芽势都有了明显的降低，到了处理70 min时，799和223发芽势均低于20%，新陆早36号也降到了80%以下，3个材料发芽势具有一致的变化规律。另外，新陆早36号发芽势各个处理水平均处在最高的水平，而且不同处理之间变化幅度也不大。紧随其后的是799，223则最差，发芽势最弱，而且处理之间变化显著。

表1热水老化后棉花种子发芽率和活力的变化

老化时间(min)　　　　　新陆早36号　　　　　　　　　　　　799　　　　　　　　　　　　　　223　　　　　　　发芽率(%)活力指数发芽率(%)活力指数发芽率(%)活力指数098．9±1．92a21．9±0．88c100．0±0．00a24．9±1．68a97．8±1．92ab23．9±0．54a1097．8±3．85a22．7±1．06bc98．9±1．92a29．2±2．42a100．0±0．00a27．7±3．13a20100±0．00a24．8±1．75abc98．9±1．92a23．7±1．49a98．9±1．92ab24．9±1．72a3097．8±1．92a28．7±1．43a98．9±1．92a29．8±1．23a87．8±3．85ab24．1±1．23a4091．1±1．92ab27．1±2．00ab86．7±3．33a25．5±2．43a73．3±8．82c17．1±2．30b5080．0±5．77c22．6±2．86bc66．7±15．28b14．2±5．72b85．6±3．85bc18．0±1．35b6085．6±1．92bc21．8±0．56c40．0±6．67c5．9±1．44c28．9±8．39d3．8±0．83c7070．0±6．67d16．3±1．87d10．0±3．33d0．7±0．66c6．7±3．33e0．5±0．53c

注：同列不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。

图1　热水老化对棉花种子发芽势的影响

2.2　热水处理对棉花种子活力的影响

由表1可以看出，在10，20 min和30 min的热水处理后3个供试材料的种子发芽率均在85%以上。甚至在40 min的时候，新陆早36号和799种子的发芽率没有显著的降低。随着老化时间的进一步延长，所有材料发芽率出现波动，开始逐渐降低。3个材料种子活力指数变化总趋势是先增加后变小，在30 min到40 min的处理之间有一个拐点，慢慢降低。推测短时间可能活化了棉花种子内部营养物质，激活了酶活力，所以提高了种子活力[9]。

热水老化后同条件下3个材料的发芽率和活力也存在差异。从表1可以看出，30 min及之前的种子发芽率和活力，799相对于其它2个材料保持比较高的水平，新陆早36号居中，223表现最差。新陆早36号7个处理的发芽率和活力较其它材料都保持了较高水平，热水老化处理70 min时发芽率和活力指数仍可达到70%和16.3，223表现相对最差。另外，品种间各处理发芽率和活力变化幅度新陆早36号也是降低最小的，799次之，223幅度最大。以上结果说明新陆早36号棉种抗老化能力最强，其次为799和223。

2.3　热水老化对棉花种子膜透性的影响

电导率测定提供了一个间接测定质膜完整性变化的方法[10]。大量研究表明，质膜受损是种子劣变期间发生的主要生理变化之一[11-12]。相对电导率是反映植物细胞膜系统状况的一项重要的生理生化指标。逆境或受损情况下植物的细胞膜容易破裂，细胞膜蛋白受损导致细胞质胞液外渗，相对电导率增大[13]。图2显示，在65 ℃热水加速老化后，3个棉花材料种子细胞电解质产生较为一致的变化。相对电导率值变化趋势可分为2个阶段：在10～30 min的处理间，棉花种子相对电导率呈现下降的趋势；而在40 min及更长时间的热水老化处理之间，则表现为逐步增加的态势。由此可见，不超过30 min的热水浸种老化处理对棉花种子细胞膜没有产生损伤或损伤较小，种子内部电解质没有外渗，说明种子对短时间的老化处理具有一定的耐受力[9]。热水处理超过30 min，棉花种子抗老化能力达到了极限，细胞膜表现出不同程度的损伤，细胞内部电解质开始大量外渗，相对电导率随之增加，活力逐步降低，直至最后失去活力。

图2　热水老化对棉花种子电导率的影响

注：M为marker 2000;0～70 min为热水老化时间。图3　热水老化对棉花种子基因组DNA扩增产物的影响

3个棉花材料在相同处理水平上，种子细胞膜的透性存在明显的差异。3个材料对照相对电导率虽存在差异，但新陆早36号的相对电导率都是最低，而且在30 min处理水平前后的变化幅度最小，799次之，223则变化最为剧烈。说明新陆早36号的抗老化能力最强，799居中，而223则较差。

2.4　热水老化对种子遗传完整性的影响

由图3可知，供试3个材料随着老化时间的延长，799和223扩增产物中分子量接近500 bp的大片段在老化30 min后逐步变弱或者消失；同时，3个材料中处于100 bp和250 bp之间的小分子量的片段也是在30 min的处理时间后电泳条带宽度变细，亮度逐渐地减弱。可见，热水处理对棉花种子基因组DNA造成损伤，结构发生变化，引起了核酸的降解。此结果与已有的老化研究报道一致[14-15]。而且是在处理时间为30 min起基因组DNA开始发生变化。

3　讨论与结论

种子老化是一个复杂的过程，其影响因素是多方面的。即使在种质资源库的优良条件可以保存一定的年限，但是种质最终还是趋于死亡。在老化过程中，种子表现出发芽率、生活力降低、细胞膜透性增强等特点，同时种子内部的遗传物质也在发生变化[2]。本研究中，热水加速老化后的棉花材料发芽势、发芽率及活力指数都有一个逐步降低的过程，而且在30 min和40 min的处理水平之间具有一个明显的变化拐点：处理超过30 min后都呈现显著的降低态势。中国科学院昆明植物研究所陈虹颖博士与英国专家合作研究发现，种子老化过程是一个由基因控制的过程，而且老化过程启动了细胞程序性死亡，最终导致种子活力的丧失。通过对豌豆种子老化过程中种子活力与基因表达以及谷胱甘肽氧化还原状态之间的关系进行了检测分析，发现当种子老化过程开始启动，虽然萌发率仍维持在100% 的水平，但部分DNA和RNA已开始降解[16]。本试验也有类似的结果。虽然棉花种子在40 min的老化处理后发芽指标(发芽势和发芽率)仍然保持在较高的水平，但种子活力已经发生了明显的降低。与此同时，棉花种子基因组DNA的扩增产物也发生变化，出现了片段降解和片段弱化，说明热水老化引起了棉花种子基因组DNA的损伤，结构发生变化，核酸出现降解。

综上所述， 65 ℃热水能够加速棉花种子老化。棉花种子对65 ℃热水逆境在30～40 min存在一个临界点。30 min处理棉花种子的发芽率及活力指数处于顶峰值，所以说此水平的处理有利于促进棉花种质活力的发挥，在大田生产中可利用这一规律来提高棉花田间的发芽率和种子活力，为后续的稳产与丰产提供足额健壮的棉苗支撑。供试3个棉花材料抗老化能力存在差异，新陆早36号最强，其次是799和223。

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