表皮生长因子对缺氧缺糖模型大鼠骨骼肌细胞氧化损伤的保护作用

许雪梅，黄笑夏，金　瓯，张海邻，时洪雪

(1.浙江省温州市中西医结合医院药剂科，浙江 温州 325000；2.浙江省温州市中医院药剂科，浙江 温州 325000；3.温州医科大学附属第二医院儿科，浙江 温州 325000; 4.温州医科大学药学院临床药学系，浙江 温州 325000)

压疮深部组织损伤(deep tissue injury，DTI)是压疮中最严重类型，好发于受压骨隆突处，是临床护理工作的重点和难点[1]。DTI可有皮肤深部组织肌层损伤，局部持续受压时，由于血流灌注受阻、大量自由基产生造成肌细胞损伤。近年研究[2-3]显示: 氧化应激、凋亡及炎性反应在压疮的发生发展过程中具有重要促进作用，尤其缺血缺氧损伤产生的氧化应激反应是导致细胞损伤及凋亡的重要机制，也是发展为DTI的重要因素。因此抑制氧化应激是治疗DTI的关键。表皮生长因子(epithelial growth factor,EGF)是一种重要的细胞生长因子，具有明显的促增殖抗氧化及抗凋亡作用[5-6]。有研究[7]显示：给予EGF局部浸润对糖尿病足具有明显的改善作用，但是EGF是否对压疮的深部组织尤其是肌细胞损伤具有保护作用尚未见报道。因此，本研究构建大鼠骨骼肌细胞缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation,OGD)模型，观察OGD对骨骼肌细胞损伤的影响以及EGF的保护机制，以期为临床压疮DTI的修复提供良好的治疗策略。

1　材料与方法

1.1细胞、主要试剂和仪器大鼠骨骼肌L6成肌细胞(上海中科院研究所)。DMDM培养液和新生牛血清(美国Hyclone公司)，PI-FITC凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)，罗丹明123和EGF(美国Sigma公司)，Western blotting蛋白检测一抗抗体(美国Abcam公司)，二抗抗体(美国Thermo公司)。高速低温离心机(美国Sigma公司)，倒置光学显微镜(北京恒奥德仪表有限公司)， 流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2大鼠骨骼肌成肌细胞培养大鼠骨骼肌L6细胞置于完全培养基(10%胎牛血清，高糖 DMDM培养液，pH7.4)中，于37℃、5% CO2培养箱中培养。每2～3 d用0.25%胰酶消化后，换液传代培养。

1.3亚甲基四唑蓝(MTT)法测定细胞生存率取对数生长期大鼠骨骼肌细胞，经消化制成细胞悬液，以每孔100 μL、1×104个细胞接种于96孔板，实验分为正常对照组、OGD组、5 μg·L-1EGF +OGD组、10 μg·L-1EGF +OGD组和20 μg·L-1EGF+OGD组。正常组细胞放置于常氧培养箱(20% O2，DMEM常规培养)中。OGD组和EGF+OGD组细胞培养液换成无糖的DMEM培养液后分别加入不同浓度(5、10和20 μg·L-1) EGF，孵育16 h后，放入低氧培养箱(1% O2)。在20 h后加入MTT (5 g·L-1) 20 μL，继续培养4 h后吸出培养液，加入DMSO 150 μL，振荡10 min，于570 nm处测其吸光度(A)值。实验重复3次。细胞生存率=(实验组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100%。

1.4流式细胞术检测细胞凋亡率取对数生长期大鼠骨骼肌细胞，经消化制成细胞悬液，以每瓶5×106个细胞接种于培养瓶中，根据实验分组，加入不同浓度EGF (5、10和20 μg·L-1)，放于低氧培养箱，24 h后用PBS洗2次，收集细胞，弃上清，分别加入终浓度1 mg·L-1的 PI和Annexin Ⅴ-FITC，37℃孵育15 min，PBS洗2次，流式细胞仪检测各组样品每10 000个细胞中的细胞凋亡率。细胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.5DCFH-DA试剂盒检测细胞中活性氧(reactive oxygen specics,ROS)水平取对数生长期大鼠骨骼肌细胞，按照实验分组加药处理后，分别放于常氧和低氧培养箱，24 h后用PBS洗2次，随后加入无血清培养基稀释的DCFH-DA，使其终浓度为10 μmol·L-1，放于37℃细胞培养箱中孵育20 min。应用荧光酶标仪(485 nm激发和535 nm发射波长)进行检测。实验重复3次。计算每组的平均荧光值，设定正常对照组细胞的平均荧光强度为100%。

1.6线粒体膜电势测定取对数生长期大鼠骨骼肌细胞，按照上述方法分组，加入药物后进行常规培养后，加入10 μmol·L-1Rhodamine 123后，放于37℃细胞培养箱中孵育20 min。使用PBS洗3次，15 min后，应用荧光酶标仪进行检测。计算每组的平均荧光值，设定正常对照组细胞的平均荧光强度为100%。

1.7蛋白免疫印迹检测细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达收集细胞，提取细胞胞浆蛋白，Bio-Rad 法测定蛋白表达水平。取蛋白60 μg行SDS-PAGE电泳，将蛋白样本转移至硝酸纤维素滤膜上。膜用5%脱脂奶粉封闭1 h，PBST洗3次，加入抗Bcl-2 (1∶1 000) 和Bax抗体(1∶500)，4℃过夜。PBST洗3 次,相应加入过氧化物酶标记二抗，放在脱色摇床摇1 h，PBST 洗3 次。Bio-Rad凝胶成像系统拍照分析。以β-actin为内参蛋白，实验重复3 次。蛋白表达水平=待测蛋白灰度值/β-actin 蛋白灰度值。

2　结　果

2.1各组骨骼肌细胞生存率和凋亡率MTT法检测结果显示：与正常对照组比较，OGD 24 h时OGD组骨骼肌细胞生存率明显下降(P<0.01)；与OGD组比较，不同浓度EGF组骨骼肌细胞生存率升高，其中10和20 μg·L-1EGF组骨骼肌细胞生存率明显升高(P<0.05或P<0.01)。流式细胞术检测结果显示：与正常对照组比较，OGD 24 h时OGD组骨骼肌细胞凋亡率明显升高 (P<0.01)；与OGD组比较，10和20 μg·L-1EGF+OGD组骨骼肌细胞凋亡率明显降低 (P<0.05或P<0.01)。见表1。

表1各组大鼠骨骼肌细胞生存率和凋亡率

GroupSurvivalrateApoptoticrateNormalcontrol100．00±4．514．10±0．92OGD80．10±7．65∗18．20±2．16∗EGF(5μg·L-1)+OGD82．00±6．6316．90±1．23EGF(10μg·L-1)+OGD89．70±5．16△13．20±2．31△EGF(20μg·L-1)+OGD93．30±3．82△△8．60±2．43△△

*P<0.05,**P<0.01vsnormal control group;△P<0.05,△△P<0.01vsOGD group.

2.2各组骨骼肌细胞中ROS水平和线粒体膜电势DCFH-DA检测细胞中ROS水平结果显示：与正常对照组比较，OGD 24 h时OGD组骨骼肌细胞中ROS水平明显升高 (P<0.01)；与OGD组比较，不同浓度EGF组骨骼肌细胞中ROS水平明显降低 (P<0.05或P<0.01)，并呈浓度依赖性。流式细胞仪检测线粒体膜电势结果显示：与正常对照组比较，OGD组细胞线粒体膜电势明显下降(P<0.01)；与OGD组比较，不同浓度EGF组细胞线粒体膜电势明显升高(P<0.05或P<0.01)。见表2。

表2各组大鼠骨骼肌细胞中ROS水平和线粒体膜电势

GroupROSlevelRelativeRho123fluoresenceintensityNormalcontrol100．00±4．69100．00±2．83OGD193．20±7．38∗∗53．60±9．61∗EGF(5μg·L-1)+OGD175．60±3．6759．30±4．92EGF(10μg·L-1)+OGD162．10±6．80△73．60±3．32△EGF(20μg·L-1)+OGD129．30±4．35△△87．45±1．99△△

*P<0.05,**P<0.01vsnormal control group;△P<0.05,△△P<0.01vsOGD group.

2.3各组骨骼肌细胞中线粒体相关蛋白表达水平Western blotting法检测结果显示：与正常对照组比较，OGD 24 h时OGD组骨骼肌细胞中线粒体膜蛋白Bax表达水平明显升高，Bcl-2蛋白表达水平下降，Bcl-2/Bax比值明显下降(P<0.01)；与OGD组比较，各浓度EGF组Bax蛋白表达水平下降，Bcl-2蛋白表达水平升高，Bcl-2/Bax比值升高，并具有浓度依赖性，尤其10和20 μg·L-1EGF+OGD组效果明显(P<0.05或P<0.01)。见图1。

Lane 1:Normal control group;Lane 2:OGD group;Lane 3:5 μg·L-1EGF+OGD group;Lane 4:10 μg·L-1EGF+OGD group;Lane 5:20 μg·L-1EGF+OGD group.*P<0.01vsnormal control group;ΔP<0.05 ;ΔΔP<0.01vsOGD group.

图1各组大鼠骨骼肌细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达电泳图(A)和Bcl-2/Bax比值直条图(B)

Fig.1Electrophoregram of expressions of Bcl-2 and Bax proteins in skeletal muscle cells(A) and histogram of ratios of Bcl-2/Bax(B) of rats in various groups

3　讨　论

DTI是一类危害严重的深部组织慢性难愈性溃疡,主要发生在急危重症及长期卧床患者，主要累及皮肤全层，伴有骨骼肌腱及肌肉的损伤[8]。近些年来研究[9-10]发现：DTI并非急性高压力性损伤，而是由间歇性较低压力重复作用造成的局部不完全缺血缺氧损伤，由此生成的氧自由基持续反应造成肌细胞线粒体损伤、DNA断裂和脂质过氧化等反应。缺血缺氧诱导产生的氧化应激进而引起的线粒体损伤导致骨骼肌细胞损伤及进一步的肌组织降解，是DTI形成的关键。研究[11-12]显示：肢体不同组织对缺血缺氧的耐受性不同，骨骼肌细胞对缺血缺氧损伤最为敏感，缺血4～6 h即可发生不可逆损伤，而肌组织损伤的同时又会发生一系列的细胞因子水平改变，导致组织再生障碍，因此分析压疮深部组织骨骼肌细胞损伤和修复机制尤为重要。本实验建立大鼠骨骼肌细胞OGD模型，在细胞水平上模拟压疮动物模型，观察骨骼肌细胞损伤过程中病理生理学的微观改变，可为压疮深部骨骼肌细胞损伤研究提供新思路。

压疮早期深部组织骨骼肌细胞减少不易被发现，而后期肌细胞活性及生长率降低可能是压疮恶性难愈的重要因素[13]。本实验采用MTT法检测细胞活性，采用流式细胞术检测细胞凋亡，发现OGD增加了骨骼肌细胞凋亡，但是其损伤机制尚不明确。有研究[14]显示线粒体损伤在真核细胞凋亡过程中具有重要的枢纽作用。在OGD时，线粒体膜通透性增加，膜电势发生改变，ROS水平改变，最终导致细胞凋亡[15]。在利用果糖模拟Ⅱ型糖尿病肌细胞损伤模型中，氧化应激和Bcl-2家族成员水平的变化，是骨骼肌细胞损伤的关键因素[16]。棕榈酸盐诱导的L6细胞线粒体DNA损伤模型中，典型的变化也与氧化应激和线粒体功能改变密切相关[17]。本实验中流式细胞术检测结果显示：OGD能明显增加骨骼肌细胞内ROS水平。同时，罗丹明123检测线粒体膜电势结果表明OGD降低了骨骼肌细胞膜电势。Western blotting检测结果显示：OGD明显降低Bcl-2/Bax比值，且降低骨骼肌细胞的抗凋亡能力。由此可见，OGD通过激活ROS、损伤线粒体功能引起大鼠骨骼肌细胞凋亡，这可能是压疮肌组织损伤的关键因素之一。

EGF是一种广泛存在于体液和多种腺体的生物活性肽类[18]。研究[19]显示：EGF可刺激多种细胞的增殖，包括表皮细胞和内皮细胞等；在烫伤及手术等创面的修复和愈合方面取得良好疗效。在EGF保护酒精引起的内皮细胞损伤模型中，线粒体中Bcl-2和Bax表达改变是其保护效应的关键，进而能够调控下游的TNF-α和NF-κB等炎症因子的水平[20]。但是关于EGF与介导压疮DTI的机制还不明确。本研究结果证实: 给予不同浓度EGF时，OGD引起的细胞生存率下降明显上升，凋亡率也明显下降，并具有浓度依赖性，提示EGF具有明显的细胞损伤保护效应；DCFH-DA检测结果表明：不同浓度EGF明显降低OGD引起ROS水平增加,并且改善了膜电势水平的降低；Western blotting法检测结果表明：EGF明显增加了Bcl-2/Bax的比值。以上结果说明：EGF的保护机制可能与降低OGD引起的细胞中ROS水平增加及保护线粒体功能有关，可能是EGF在DTI和难愈性溃疡中发挥促进修复作用的主要机制。

本实验以骨骼肌L6成肌细胞为基础，通过OGD因素来模拟DTI病理生理过程，骨骼肌细胞在OGD 24 h后生存率降低，细胞凋亡明显，ROS水平增加，线粒体膜电势水平下降，Bcl-2/Bax比值明显降低。当提前给予不同浓度EGF时，通过降低ROS水平、保护线粒体功能来改善OGD引起的生存率下降，进而发挥抗骨骼肌细胞凋亡的作用。本文作者推测：EGF可能通过调节氧化应激和线粒体凋亡途径缓解以肌细胞受累为主的大鼠压疮DTI，本研究结果为临床DTI的治疗和研究提供了新的思路。

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