木葡聚糖基温敏水凝胶预防大鼠腹壁-肠壁再粘连及其对局部TGF-β1和CTGF表达的影响

孙　红，李硕峰，崔　菁，张二帅，李景武，熊艳杰，马丽桃，姚芳莲，车鹏程

(1.华北理工大学基础医学院 河北省慢性病重点实验室 唐山市慢性病临床基础研究重点实验室，河北 唐山 063210；2.天津大学化工学院高分子科学与工程系，天津 300350；3.河北省唐山市人民医院腹盆外科，河北 唐山 063001；4.华北理工大学附属医院病理科，河北 唐山 063000)

临床上对于既已形成的粘连多采用粘连松解手术进行分离，但对粘连组织分离的同时又会造成新的创伤，粘连松解术后再粘连的发生率高达50%，因此对于粘连松解术后预防再粘连的研究具有非常重要的临床意义[1-2]。目前预防术后粘连的方法大多针对于普通腹腔外科手术后引起的粘连[3-4]，对于粘连机制更加复杂的粘连松解术后再次粘连的预防效果尚不清楚。研究[5-7]显示:聚乙二醇-聚己内酯-聚乙二醇(PEG-PCL-PEG)温敏凝胶在大鼠腹壁-盲肠缺损模型中均取得了良好的防粘连效果，然而在大鼠腹壁盲肠粘连松解术后的二次损伤模型中却未能有效地预防再次粘连的发生。

本文作者前期研究[8]表明：木葡聚糖基(mXG)温敏水凝胶具有可逆的“低温溶胶，体温凝胶”温敏行为，有很好的细胞相容性，对普通手术后的腹腔粘连有优异的防粘连效果。4% mXG溶液溶胶-凝胶转变温度为23℃，在37℃下凝胶过程在3 min内即可完成，并且有较高的凝胶强度，因此本文作者推测其对预防粘连松解术后再粘连的发生可能也具有一定的效果。本研究在以往工作的基础上，进一步评价mXG温敏水凝胶对成纤维细胞的抗黏附性能，并构建粘连松解术后再次粘连动物模型，在此基础上评价mXG温敏水凝胶对于粘连松解术后再粘连发生的预防效果及对转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)表达的影响，旨在为解决粘连松解术后再粘连这一临床难题提供新的治疗方法。

1　材料与方法

1.1实验动物、细胞和主要试剂健康雄性SD大鼠55只，由华北理工大学动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK(京)2004-0004。所有大鼠在温度(22±2)℃、相对湿度(50±5)%环境下单笼饲养，期间提供充足的水和饲料，实验前保证至少1周的适应性饲养，术前12 h禁食。带有绿色荧光的L929鼠成纤维细胞(3T3 小鼠胚胎成纤维细胞)由军事医学科学院微生物流行病研究所提供。mXG温敏水凝胶由天津大学化工学院合成，医用壳聚糖防粘连膜粘停宁为烟台万利医用品有限公司产品，TGF-β1和CTGF多克隆抗体为Affinity公司产品，免疫组织化学通用二抗PV6000为北京中杉金桥生物技术有限公司产品，Van Gieson为珠海贝索生物技术有限公司产品，RPMI-1640和胎牛血清为美国Gibco公司产品。

1.2mXG温敏水凝胶抗细胞黏附性能检测将0.2 mL 4%mXG溶液加入48孔培养板中，移至37℃孵育1 h，使其完全凝胶。在每孔中加入1 mL含有10%FBS的RPMI-1640培养基，将含有绿色荧光标记的L929鼠成纤维细胞以1×104mL-1密度、在37℃、5%CO2的培养箱中培养。以直接在孔板中培养的细胞作为对照。培养48 h后，荧光显微镜下观察凝胶表面细胞的数量和形态。

1.3大鼠腹壁-盲肠粘连松解术后再次粘连模型建立制作腹壁1 cm×2 cm大小、深约1 mm的创面；在与腹壁创面相对应的盲肠表面使用手术刷轻轻磨擦直到盲肠浆膜层被破坏至有明显的点状出血，将盲肠和腹壁表面悬吊缝合，使盲肠创面和腹壁创面相对合以确保粘连形成。术后7 d，钝性分离粘连组织，创面摩擦处理至有明显的渗血，连续缝合关腹。常规肌肉注射消炎药。为了验证模型的有效性，二次术后第7天处死大鼠，再次开腹验证粘连松解术后再次粘连的情况。

1.4mXG水凝胶对粘连松解术后再次粘连效果的评价在一次损伤后发生粘连的大鼠中选择48只粘连评分接近的实验动物，对其实施粘连松解手术，随机分为3组(n=16)：再粘连组、商业膜组和mXG水凝胶组。再粘连组在关腹前将1 mL生理盐水注射于大鼠腹壁和盲肠的创面；商业膜组将2 cm× 3 cm大小的医用壳聚糖防粘连膜粘停宁覆盖于大鼠腹壁创面后关腹；mXG水凝胶组将1 mL 4% mXG温敏水凝胶注射至大鼠腹壁和盲肠的创面，待凝胶完全形成后关腹。术后第7和14天分别处死各组大鼠8只，并按照以下评分标准对粘连程度进行评分[9]：0分，完全无粘连；1分，腹腔内有一处薄的粘连；2 分，有不止一处的疏松粘连；3 分，有比较致密的粘连；4 分，有不止一处的致密粘连；5 分，广泛而致密的血管化粘连。对于粘连发生的区域，切取腹壁-盲肠粘连区域的组织；对于未粘连的区域，分别切取腹壁和盲肠的创面组织，固定、包埋，连续切片行HE染色、Van Gieson染色和免疫组织化学染色，观察TGF-β1和CTGF表达情况， TGF-β1阳性细胞为细胞质或细胞核内出现棕黄或棕褐色颗粒，CTGF阳性细胞为细胞质内出现棕黄或棕褐色颗粒。

2　结　果

2.1mXG温敏水凝胶内L929鼠成纤维细胞的粘附性能再粘连组中可见大量L929鼠成纤维细胞贴壁生长，呈细长的梭形并有伪足形成；在mXG温敏水凝胶组mXG温敏水凝胶表面仅有非常少的细胞，由于不能很好地贴壁，这些细胞大都呈圆球状。见图1(插页一)。

2.2腹壁-肠壁粘连松解术后再次粘连的形态表现为了验证模型的有效性，二次手术后第7天处死大鼠，再次开腹验证粘连松解术后再次粘连的情况，所有经粘连松解术后再次损伤的大鼠腹壁与盲肠间均发生了严重的粘连，证明了腹壁-盲肠粘连松解术后再损伤粘连模型的有效性和稳定性。见图2(插页二)。

2.3再粘连术后粘连程度评分根据评分标准对各组大鼠术后粘连情况进行评分和统计，结果如表1所示。在再粘连组，术后第7天所有大鼠均发生了4～5分的严重粘连，第14天多数大鼠形成了5分粘连。在商业膜组，术后第7天时的粘连主要集中在3～4分，而在第14天时多数均形成4～5分的粘连，商业膜组粘连评分与再粘连组接近，但差异无统计学意义(P>0.05)。在mXG温敏水凝胶组，多数大鼠均未发生粘连，少数几只大鼠发生粘连，但仅是1分的轻度粘连；mXG温敏水凝胶组粘连评分低于再粘连组(P<0.05)。

表1术后第7和14天各组大鼠损伤部位粘连评分

GroupAdhesionscore(t/d)　　714Adhesion4．25±0．464．88±0．35Commercial　membrane3．50±0．934．10±0．76mXGhydrogel0．13±0．35∗△0．25±0．46∗△

*P<0.05vsadhesion group;△P<0.05 compared with commerial membrane group.

2.4再粘连术后第7天组织病理学表现术后第7天的组织学结果显示：再粘连组浆膜层连续性中断，纤维结缔组织增生情况严重，有大量中性粒细胞及巨噬细胞；商业膜组浆膜层连续，增生的结缔组织厚度低于再粘连组，但胶原纤维较致密。mXG组盲肠和腹壁创面恢复平整，但纤维结缔组织增生较多，且可见纤维组织中包裹着未降解的凝胶团。在再粘连组和商业膜组中，腹壁和盲肠间存在明显的粘连区域(虚线内)，这一区域在Van Gieson特殊染色中被特异性地染成红色。见图3(插页二)。

2.5再粘连术后第14天组织病理学表现术后第14天组织学结果显示：再粘连组的粘连区域胶原纤维沉积明显增多，粘连变得更为致密，部分区域可以观察到有新生血管的出现，而且粘连区域的厚度相对于第7天时也有所增加；商业膜组粘连区域的厚度未见明显增加，但粘连组织相对于第7天时变得更加规整和致密，而且部分区域有新生血管的出现；与第7天时比较，mXG温敏水凝胶组第14天时腹壁创面组织中的炎性细胞明显减少，未见凝胶的残留，新生间皮层下原来存在的纤维蛋白沉积物在纤维蛋白溶解酶系统的作用下也逐渐地被降解和吸收，愈合后的组织变薄。盲肠的愈合情况与腹壁类似，但仍可见少量的纤维包裹的残留凝胶。见图4(插页二)。

2.6再粘连术后TGF-β1和CTGF表达情况术后第7天，再粘连组与商业膜组在巨噬细胞、血管内皮细胞及邻近的成纤维细胞中可见TGF-β1和CTGF呈强阳性表达；mXG组TGF-β1和CTGF阳性表达则较弱，阳性部位为组织内血管内皮细胞胞浆。术后第14天，再粘连组与商业膜组TGF-β1和CTGF表达呈弥漫阳性表达，主要在成纤维细胞和血管内皮细胞胞浆；mXG组细胞排列整齐，在结缔组织内TGF-β1主要表达于成纤维细胞。各组TGF-β1和CTGF的表达情况与大体观察、HE和Van Gieson染色结果一致。见图5和6(插页二)。

3　讨　论

术后粘连是腹部手术引起的一种后遗症，轻者影响肠道的运动功能，导致腹痛和腹胀等症状，重者出现肠梗阻乃至肠坏死。普通腹部外科手术后腹部粘连发生率为76%[10]。粘连松解术后再次粘连的情况不容忽视，然而对于预防粘连松解术后再次粘连的研究国内少有报道，作为这一研究的基础，成功构建粘连松解术后再次粘连动物模型尤为重要。本研究实验结果表明经粘连松解术后再次损伤的动物腹壁与盲肠间均发生了严重的粘连，建立了粘连松解术后再次粘连动物模型，在该模型有效性和稳定性的基础上，研究和开发能够有效预防粘连松解术后再次粘连的材料具有重要的临床意义。

温敏水凝胶由于兼具液态类材料的操作便利性和固态类材料的物理屏障性，并能结合微创疗法，在术后防粘连领域得到了广泛的关注。Yang等[11]新近报道一种新型光诱导亚胺交联水凝胶—CNG hydrogel,该水凝胶便于术中操作使用，有很好的生物相容性，易于降解。Chen等[12]报道了含透明质酸与壳聚糖的可注射温敏水凝胶，有良好的预防腹腔粘连的效果，但缺乏对粘连松解术后再次粘连的研究报道。因此研究和开发能够有效预防粘连松解术后再次粘连的材料，具有重要的临床意义。

本课题组前期利用绿色酶解反应制得了具有反向温敏行为的mXG温敏水凝胶，基于mXG的可注射性、良好的生物相容性及生物可降解性，首次将其应用于术后防粘连的研究中，在注射至腹壁和盲肠的创面后能够快速地原位形成具有较高强度的凝胶，并且能够在原位维持较好的完整性，所以其能够在粘连形成的关键时期有效地将腹壁和盲肠的创面进行隔离，避免了创面的相互接触而形成粘连，不仅提高了手术操作的便利性，而且在SD大鼠腹壁-盲肠损伤模型中取得了良好的预防术后粘连的效果[8]。

成纤维细胞和胶原纤维在创面的沉积是导致术后粘连形成的关键因素[13]。成纤维细胞在粘连的形成过程中起着非常重要的作用，因此如果能够有效地阻抗成纤维细胞的黏附，则可以显著地提升术后防粘连的效果。本研究将L929鼠成纤维细胞接种于mXG温敏水凝胶表面，研究其在水凝胶表面的黏附行为。本实验中抗细胞黏附性能研究结果显示：相对于再粘连组大量L929鼠成纤维细胞贴壁梭形生长，伴伪足的形成，mXG温敏水凝胶表面仅有非常少的细胞，呈圆球状，表明mXG温敏水凝胶具有很好的抗成纤维细胞黏附性能。鉴于mXG温敏水凝胶有较高的凝胶强度，在有效发挥物理隔离作用的同时，还能够明显阻抗成纤维细胞的黏附，本文作者预测mXG温敏水凝胶能更好地预防粘连松解术后再次粘连的发生。

本实验中大体观察和粘连程度评分结果显示：再粘连组均发生了严重的粘连，粘连评分均在4～5分，组织病理学观察可见粘连部分有大量胶原纤维存在，且有新生血管出现，这表明粘连松解术后再次粘连实验动物模型构建成功。商业膜组大鼠均发生粘连，粘连情况接近再粘连组，但粘连评分结果略低于再粘连组，组织病理学观察可见粘连区域厚度并未随着时间的延长而增厚，但粘连部分区域有新生血管生成，可见商业膜对粘连松解术后再次粘连的预防效果甚微。mXG温敏水凝胶组中仅有2只大鼠发生轻微粘连，粘连评分在0～1分，其余均未发生粘连，随着时间的延长损伤部位炎性细胞逐渐减少，凝胶逐渐降解，组织逐渐愈合变薄。mXG温敏水凝胶具有优异的温敏性，在注射至腹壁和盲肠的创面后能够快速地原位形成具有较高强度的凝胶，起到很好的物理覆盖作用，并且mXG温敏水凝胶降解过程中也能够在原位维持较好的完整性。mXG温敏水凝胶在大鼠腹壁-盲肠粘连松解术后二次损伤粘连模型中能够有效地预防粘连的发生。

术后粘连形成的过程非常复杂,其中涉及各种生长因子和细胞因子的参与，根据其功能可分为抗粘连细胞因子和促粘连细胞因子两类，大量文献[14-15]表明TGF-β1和CTGF在腹腔粘连的发生发展中起到了重要的作用。

目前公认TGF-β在腹膜粘连形成过程中发挥关键作用，以TGF-β1作用最强[16]，TGF-β1通过自分泌和旁分泌机制激活成纤维细胞产生胶原，阻断纤维蛋白溶解酶原激活物，增加血管形成和趋化成纤维细胞、单核细胞及巨噬细胞，破坏纤维蛋白溶解与合成平衡，导致细胞外基质沉积而有助于粘连的形成，阻断其作用已证实可达到预防腹膜粘连形成的效果[17]。

CTGF是一种富含半胱氨酸的分泌性多肽，可由成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞合成分泌。近年研究[18-19]显示：CTGF是介导TGF-β1促纤维化作用的一个重要的下游因子。Thaler等[18]发现：模型大鼠术后腹腔粘连组织中 CTGF水平高于正常对照组，其高峰出现在术后第6～15天，CTGF水平随着粘连组织中胶原的表达而变化，故认为CTGF与腹膜粘连形成有重要的关系。本研究结果显示：对照组术后第7和14天均可见TGF-β1和CTGF高表达，商业膜组早期起到一定的物理隔离作用，防粘连膜虽然在使用前为固态膜，但是植入体内后在创面渗血和腹腔液的作用下会很快变为黏稠的溶液状态，难以长时间地存留于创面，因而不能在粘连形成的关键时期起到有效的物理阻隔作用，所以在纤维蛋白原渗出的基础上，有不同程度的CTGF表达。mXG温敏水凝胶可以完全覆盖在伤口表面，并且有较高的凝胶强度，一方面在术后早期起到隔离作用，阻止纤维蛋白原的渗出；另一方面mXG温敏水凝胶有很好的生物相容性和可降解性，不会对机体产生不良影响，所以在术后第7和14天TGF-β1和CTGF只有弱阳性表达，这与HE和Van Gieson染色结果一致，表明mXG温敏水凝胶可以有效预防粘连松解术后再次粘连的发生。

本实验结果显示：采用大鼠构建粘连松解术后再次粘连动物模型成功率高。本实验成功复制了临床上比较复杂的粘连松解术后再次粘连病症模型，并且证实mXG温敏水凝胶具有很好的预防粘连松解术后再次粘连的效果，为今后研究腹腔术后粘连奠定了良好的实验基础，也为解决粘连松解术后再粘连这一临床难题提供了新的治疗方法。

[参考文献]

[1] Diamond MP,Wexner SD,diZereg GS,et al.Adhesion prevention and reduction: current status and future recommendations of a multinational interdisciplinary consensus conference[J].Surg Innov,2010,17(3):183-188.

[2] Brochhausen C,Schmitt VH,Planck CN,et al.Current strategies and future perspectives for intraperitoneal adhesion prevention[J].J Gastrointest Surg,2012,16 (6):1256-1274.

[3] Ward BC,Panitch A.Abdominal adhesions: current and novel therapies[J].J Surg Res,2011,165:91-111.

[4] 刘国辉,李有柱,赵军.羧甲基纤维素钠在预防术后腹膜粘连中的作用[J].吉林大学学报:医学版,2002,28(2):163-164.

[5] Yang B,Gong C,Zhao X,et al.Preventing postoperative abdominal adhesions in a rat model with PEG-PCL-PEG hydrogel[J].Int J Nanomed,2012,7:547-557.

[6] Gao X,Deng X,Wei X,et al.Novel thermosensitive hydrogel for preventingformation of abdominal adhesions[J].Int J Nanomed,2013,8:2453-2463.

[7] Wu Q,Wang N,He T,et al.Thermosensitive hydrogel containing dexamethasone micelles for preventing postsurgical adhesion in a repeated-injury model[J].Sci Rep,2015,5:13553.

[8] Zhang E,Li J,Zhou Y,et al.Biodegradable and injectable thermoreversible xyloglucan based hydrogel for prevention of postoperative adhesion[J].Acta Biomater,2017,55:420-433.

[9] Nair SK,Bhat IK,Aurora AL.Role of proteolytic enzyme in the prevention of postoperative intraperitoneal adhesions[J].Arch Surg,1974,108(6):849-853.

[10]Okabayashi K,Ashrafian H,Zacharakis E,et al.Adhesions after abdominal surgery: a systematic review of the incidence,distribution and severity[J].Surg Today,2014,44(3):405-420.

[11]Yang Y,Liu X,Li Y,et al.A postoperative anti-adhesion barrier based on photoinduced imine-crosslinking hydrogel with tissue-adhesive ability[J].Acta Biomater,2017,62:199-209.

[12]Chen CH,Chen SH,Mao SH,et al.Injectable thermosensitive hydrogel containing hyaluronic acid and chitosan as a barrier for prevention of postoperative peritoneal adhesion[J].Carbohydr Polym,2017,173:721-731.

[13]Bae SH,Son SR,Kumar Sakar S,et al.Evaluation of the potential anti-adhesion effect of the PVA/Gelatin membrane[J].J Biomed Mater Res Part B Appl Biomater,2014,102(4):840-849.

[14]Wei G,Chen X,Wang G,et al.Effect of resveratrol on the prevention of intra-abdominal adhesion formation in a rat model[J].Cell Physiol Biochem,2016,39(1):33-46.

[15]Zhang H,Song Y,Li Z,et al.Evaluation of ligustrazine on the prevention of experimentally induced abdominal adhesions in rats[J].Int J Surg,2015,211(6):115-121.

[16]Zhang H,Song Y,Li Z,et al.Evaluation of breviscapine on prevention of experimentally induced abdominal adhesions in rats[J].Am J Surg,2016,211(6):1143-1152.

[17]Yigitler C,Karakas DO,Kucukodaci Z,et al.Adhesion-preventing properties of 4% icodextrin and canola oil: a comparative experimental study[J].Clinics,2012,67(11):1303-1308.

[18]Thaler K,Mack JA,Berho M,et al.Coincidence of connective tissue growth factor expression with fibrosis and angiogenesis in postoperative peritoneal adhesion formation[J].Eur Surg Res,2005,37(4):235-241.

[19]Ryan CK,Sax HC.Evaluation of a carboxymethylcellulose sponge for prevention of postoperative adhesions[J].Am J Surg,1995,169(1):154-159.