生物功能化AgInS2量子点的制备及其生物应用

卢征程，邹鹏，胡思怡，李金华，王玥

（长春理工大学 理学院，长春 130022）

20世纪80年代首次发现量子点（QDs），又称半导体量子点，在受激后会产生荧光[1-2］，与传统有机染料相比，量子点[3］具有激发光谱较宽，发射光谱窄且对称，量子限域效应强，使材料的光学、电学等性质可调[4］等优点。但传统量子点材料多数是由含有毒的元素的二元化合物组成，而新型量子点材料通常由三元I-III-VI族元素组成，如铜、银、镓、铟、硫、硒等[5］。相比传统量子点材料，I-III-VI组元素组成的量子点材料具有低毒性、制备合成的可变因素更为丰富、材料可控等优点，因而有可能取代传统的二元化合物量子点[6］，受到人们的高度重视，在商业、科研等领域中表现出巨大的应用前景。银铟硫（AgInS2）便是新型材料的典型代表[7］。

AgInS2作为跃迁过程不需要声子参与的三元硫属化合物，具有较高的发光效率[8］，在低温下可通过改变活性剂用量、前驱体比例、掺杂形成固溶体或核壳结构、反应温度等制备具有可见光谱区颜色亮度可调、结构不同的高效荧光AgInS2系量子点[9］。在应用上，AgInS2量子点可以替代荧光染料分子在基因、生物成像、生物免疫技术和生物制药等研究中发挥更大的作用。更为突出的是，AgInS2量子点在生物标记方面，可以通过控制AgInS2量子点的尺寸获得高强度的、稳定的、不同的荧光光谱，不同颜色标记[10］，也可以满足生物复杂性的需求[11］。

目前高质量的AgInS2量子点大多在有机溶剂中合成，表面被油酸、油胺等有机物包裹，与生物机体不相容，需对其表面进行水相改性后才能应用于生物领域。而采用适量的表面包覆剂[12］、表面活性剂、掺杂其他元素等方法，控制形成缺陷少、粒径均一、结晶性能好且高效荧光的水相AgInS2系量子点成为该领域研究的热点和难点。

通过水相法制备水性AgInS2量子点，并利用叶酸（FA）对其进行表面修饰，制备低毒、生物兼容性较好的FA-AgInS2量子点，并探索其在生物成像方面的应用。

1 实验

1.1 实验药品及仪器

实验药品：硝酸银（AgNO3，99.9%），氯化铟（In-Cl3·4H2O，99.9%），氢氧化钠（NaOH），硫化钠（Na2S），巯基丙酸（MPA，98%），1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC·HCL），N-羟基琥珀亚酰胺（NHs），叶酸（FA），以上药品购买于西格玛奥德里奇公司（Sigma-Aldrich）；二甲基亚砜（DMSO）购于阿尔法爱莎公司（Alfa Aesar）；无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH7.4），高糖液体培养基（DMEM），青霉素/链霉素混合溶液（Penicillin-Streptomycin）购于海克隆公司（Hyclone），噻唑蓝（MTT）购于北京梦怡美生物科技有限公司。实验中使用的化学试剂均不需二次纯化，使用水皆为去离子水（DI）。

仪器：高精度电子天平（Sartorius，Quintix224-1cn），磁力搅拌器加热台（Thermo Scientific，Cimarec），超声清洗器，恒温水浴箱，移液器，透射电子显微镜（Tecnai G2 20S-twin），紫外-可见-近红外分光光度计（Agilent，Cary 5000 UV-Vis-NIR），荧光分光光度计（Agilent，Cary Eclipse），傅里叶变换红外光谱仪（Thermo Scientific，Nicolet iS 50），荧光倒置显微镜（Leica，DMI3000B），酶标仪（TECAN，Infinite M200 PRO），CO2培养箱。测试时均在室温下进行。

1.2 水性AgInS2量子点的制备

将100ml DI水和175μL MPA混合，并用NaOH将溶液的PH值调至10，分装于5个反应瓶，每瓶10mL，并编号A-E。将0.1mol AgNO3溶于50mL DI水中，分装于上述反应瓶中，每瓶5mL。将146.62mg InCl3·4H2O溶于5mL DI水中，在AE 号反应瓶中分别加入 100μL、200μL、400μL、800μL、1.2mL，使Ag+和In3+的摩尔比分别为1：0.5、1：1、1：2、1：4、1：6。将75.8mg质量分数为78.4%的Na2S溶于5mL DI水中。在A-E号反应瓶中分别加适量的DI水，使每瓶的溶液体积均为19mL，磁力搅拌5min。将5个反应瓶同时置于加热搅拌台上，磁力搅拌并加热至95°C。在A-E号反应瓶内分别加入第四步制得的Na2S溶液1mL，保持95°C，磁力搅拌并加热2h，得到五种不同Ag+/In3+摩尔比的AgInS2量子点，保存留作以后的表征和生物应用。

1.3 水性AgInS2量子点的修饰

将5.3mg EDC、13.9mg NHs分别溶于2.4mL和3.5mL HPLC水中，得到2.3mg/mL和3.97mg/mL的EDC溶液和NHs溶液。再将6mg FA溶于3mL的HPLC水中，得到2mg/mL的FA溶液。取之前制成的Ag+/In3+摩尔比为1：4的AgInS2量子点，制成2mg/mL的溶液，向其中加入第一步中配制的EDC溶液100μL，磁力搅拌2min。向上述搅拌好的溶液中加入第一步中配制的NHs溶液100μL，磁力搅拌2min。在上述溶液中加入600μL之前配制好的FA溶液，避光磁力搅拌3h，可以得到经过叶酸修饰的AgInS2量子点。

1.4 生物实验

（1）细胞毒性测试：将经传代处理后获得的乳腺癌细胞悬液（MCF-7）稀释，从96孔板的第一行第二列起，在每列的前6个孔中加入200μL细胞悬液，共加入6列。在第一列中不加入任何物质。将96孔板放入5%的CO2恒温培养箱中培养12h。12h后更换每个孔中的培养基，并在第三列起有细胞的每个孔内加入180μL培养基，在第一列和第二列中加入200μL培养基。在第三列起的每一列的孔中，分别加入 20μL 浓度为 0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL的FA-AgInS2量子点，混合后，FA-AgInS2量子点的实际浓度为25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL。将加入样品的96孔板继续放入CO2恒温培养箱中培养24h后，在每个孔内加入20μL噻唑蓝（MTT），培养4h后，抽去每个孔中所有液体，在每个孔内加入150μL二甲基亚砜（DMSO），轻摇待紫色结晶溶解后，用酶标仪（TECAN，Infinite M200 PRO）测试细胞毒性。

（2）细胞的荧光成像：传代后经隔夜培养，乳腺癌细胞已经贴壁，使用磷酸缓冲液（PBS）冲洗有细胞的培养皿3次，去除细胞生长过程中因代谢产生的废物及剩余培养基，更换培养基后，在两盒培养皿中分别加入100μL AgInS2量子点和FA-AgInS2量子点，另外设一盒细胞中不加任何量子点，作为对照组。将三盒细胞放回5%的CO2恒温培养箱中继续培养3h后取出，抽出培养基后用PBS冲洗3次，再加入1mL PBS，将三盒细胞分别置于荧光倒置显微镜（Leica，DMI3000B）下，使用蓝色激光激发，分别拍摄明场及暗场荧光图，最终获得叠加图。

2 结果与讨论

2.1 AgInS2量子点的形貌及光学性质研究

利用水热法来制备AgInS2量子点，通过改变Ag+/In3+摩尔比例来研究其对AgInS2量子点的形貌及光学性质的影响。

图1为通过透射电子显微镜观察得到的不同Ag+/In3+摩尔比例条件下AgInS2量子点的形貌图，其中a-d分别对应Ag+/In3+摩尔比为1∶1、1∶2、1∶4、1∶6时各样品的透射电镜照片，e为统计分析超过100个AgInS2量子点的粒径后获得的对应样品的粒度分布图。

由图1可见，所制备的不同Ag+/In3+摩尔比例AgInS2量子点均呈球形，通过各样品粒度分布图观察，粒径尺寸主要分布在5nm～6nm。以上分析表明，改变Ag+/In3+摩尔比例对AgInS2量子点的形状没有影响，对量子点的粒径分布影响不大。

接下来，研究不同Ag+/In3+摩尔比例条件下AgInS2量子点的光学性质。

图2为利用紫外-红外-可见分光光度计（Agilent，Cary 5000 UV-Vis-NIR）对不同Ag+/In3+摩尔比时AgInS2量子点样品分别进行吸收光谱测试得到的光谱图。

图2 不同Ag+/In3+摩尔比时AgInS2量子点的吸收光谱图

由图2可见，AgInS2量子点在整个测试波段，即紫外-可见-近红外波段都有吸收，但是没有明显的吸收峰，研究发现，大多数可用于合成三元量子点的I-III-VI族半导体化合物均没有明显的吸收峰[13-15］。

接着，对不同Ag+/In3+摩尔比例条件下制备的AgInS2量子点，使用紫外光对其照射，并得到样品被紫外灯照射前后的照片，如图3A、B所示，其中a-e对应Ag+/In3+摩尔比分别为1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶4、1∶6。紫外光照前（A图）所得样品溶液澄清均无沉淀。紫外光照射后（B图）随着Ag+/In3+摩尔比的变化，其中In3+比例的增加，整体上样品发光有增强的趋势。

图3 不同Ag+/In3+摩尔比时AgInS2量子点在紫外光照射前后的样品图

利用用荧光分光光度计对不同Ag+/In3+摩尔比时AgInS2量子点的荧光发射光谱进行测试，激发光波长设置为450nm，激发狭缝和发射狭缝均为5nm。图4为不同Ag+/In3+摩尔比时AgInS2量子点的未归一化荧光发射光谱图及其荧光发射光谱折线图。

图4 不同Ag+/In3+摩尔比时AgInS2量子点的未归一化荧光发射光谱图及其荧光发射光谱折线图

由图4可见，与其余Ag+/In3+摩尔比时的AgInS2量子点样品相比，Ag+/In3+摩尔比为1∶4和1∶6时AgInS2量子点样品的亮度比较高，这种亮度变化趋势与紫外光照射后样品亮度的变化趋势相同。这是由于In3+的反应活性比Ag+强，因而这两种阳离子之间存在很大差异，其与S2-之间形成的键的各项性质不能统一，易在表面产生缺陷，而缺陷主要影响量子点的发光性能。因此，AgInS2量子点的发光性能可通过控制不同的组分，即不同的Ag+/In3+摩尔比来实现[16］。

对荧光发射光谱进行归一化处理，可得归一化后的不同Ag+/In3+摩尔比时AgInS2量子点的荧光光谱图，如图5所示。

图5 不同Ag+/In3+摩尔比时AgInS2量子点的归一化荧光发射光谱图

由图5可以看出，当Ag+/In3+摩尔比为1∶0.5时的发射峰为610nm；Ag+/In3+摩尔比为1∶1和1∶2时，AgInS2量子点的谱线几乎重合，发射峰分别为622nm和623nm；当Ag+/In3+摩尔比增大到1∶4和1∶6时，量子点样品的谱线的发射峰均在628nm。结果表明，随着加入的In3+的物质的量的增加，整体呈现红移的趋势。其原因可能是随着Ag+/In3+摩尔比的改变，量子点能带带隙发生了改变，结果导致量子点的发光强度及发光波长均发生了变化[17］。

通过以上分析表明，对反应中Ag+/In3+摩尔比例进行调节，当Ag+/In3+摩尔比为1∶4时样品发光强度高，因此选择此样品进行下一步叶酸的修饰。

2.2 FA-AgInS2量子点的制备及细胞成像

为了将AgInS2量子点更有效的应用于细胞成像，在AgInS2量子点的表面进一步修饰FA，并研究了FA-AgInS2量子点对乳腺癌细胞活性的影响以及在乳腺癌细胞中荧光成像的情况。

首先，利用傅里叶红外光谱仪（Thermo Scientific，Nicolet iS 50）来确认 FA、AgInS2量子点及FA-AgInS2量子点样品的化学组成。如图6所示，从下至上的三条谱线分别为FA、AgInS2量子点及FA-AgInS2量子点这三种物质的傅里叶红外光谱。

图6 叶酸、AgInS2量子点及叶酸修饰后的FA-AgInS2量子点的傅里叶光谱图

由图6可见，叶酸（FA）在1606cm-1（-NH）和1485cm-1（苯环）两处存在振动峰，AgInS2量子点在1577cm-1和1468cm-1处有两个震动峰。在经叶酸修饰后的FA-AgInS2量子点在1512cm-1和1456cm-1中也发现了两个震动峰。分析发现，与AgInS2量子点相比，FA-AgInS2量子点的的红外特征峰有明显的移动，并且FA-AgInS2量子点特征峰与FA相吻合，结果表明，叶酸和AgInS2量子点已成功结合[18］。

接下来，研究FA-AgInS2量子点细胞毒性及其在细胞成像应用。

通过改变加入到乳腺癌细胞中的FA-AgInS2量子点的样品浓度，来研究其在24h时对乳腺癌细胞活性的影响。

首先用酶标仪（TECAN，Infinite M200 PRO）测试加入了不同浓度的FA-AgInS2量子点24h后乳腺癌细胞的活性，再与不加入任何量子点样品的对照组的细胞活性进行比较，得到如图7所示的细胞毒性图，其中Control组中未加入任何量子点的乳腺癌细胞，FA-AIS组中加入了FA-AgInS2量子点。

图7 FA-AgInS2量子点在乳腺癌细胞中24小时细胞毒性图

通过图7可见，在FA-AgInS2量子点浓度分别为 25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL时，乳腺癌细胞活性分别为80%、79%、78%、76%、72%。由此可知，随着量子点浓度的增大，其毒性也随之增大，即细胞活性逐渐减小。当FA-AgInS2量子点浓度在200μg/mL时，细胞活性在80%左右，毒性结果说明该浓度在生物安全范围内，可以用于细胞成像的研究[19］。

接下来使用200μg/mL这个浓度的AgInS2量子点和FA-AgInS2量子点样品，研究其在乳腺癌细胞中荧光成像的情况。

首先将AgInS2量子点和FA-AgInS2量子点加入处理好的乳腺癌细胞中，3h后置于荧光倒置显微镜（Leica，DMI3000B）下，并用激光激发，获得细胞状态图。图8为三组乳腺癌细胞的荧光成像图，其中的a-c、d-f、g-i分别是没有加入量子点、加入AgInS2量子点和加入FA-AgInS2量子点后的乳腺癌细胞的荧光成像图像，每组图像分别为叠加图、明场图及荧光场图。

由图8可见，对照组和两组实验组中的乳腺癌细胞都保持着良好的细胞形态，没有变形或细胞壁破损的情况，这进一步证明了细胞毒性的测试结果，即AgInS2量子点和FA-AgInS2量子点的毒性较低。进一步观察可见，在没有加入任何样品的对照组中的乳腺细胞中看不到任何荧光，在加入AgInS2量子点的乳腺癌细胞中只能看到少量荧光，而加入了FA-AgInS2量子点的乳腺癌细胞中则有较多的荧光。结果表明，经叶酸修饰后的FA-AgInS2量子点的生物兼容性有明显的增强。

图8 未加入量子点的乳腺癌细胞、加入了AgInS2量子点的乳腺癌细胞与加入了FA-AgInS2量子点的乳腺癌细胞的荧光成像图像（每组图像分别为叠加图、明场、荧光场）

3 结论

采用水相合成法，制备了不同Ag+/In3+摩尔比的AgInS2量子点，利用过透射电子显微镜、吸收光谱、荧光发射光谱等测试手段对其形貌和发光性质进行研究，结果表明，当Ag+/In3+摩尔比为1：4时样品发光强度高。傅里叶红外光谱证明了叶酸对AgInS2量子点的成功修饰。后续进行的细胞毒性测试及细胞成像实验表明，经叶酸修饰的生物功能性AgInS2量子点具有低毒性、强生物兼容性等特点，在未来可用于乳腺癌体外成像研究及乳腺癌快速检测。

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