李洁 陈文成 元辉雄 韦玉霞 庞艳芳 王俊利
【关键词】 雌激素受体基因α;男性不育;基因多态性;相关性分析
中图分类号:R698+.2;R394.5 文献标识码:A DOI:10.3969/j.issn.1003-1383.2018.01.003
Analysis of correlation between gene polymorphism at rs1062577 locus of ESRα and male infertility in Zhuang nationality
LI Jie1,CHEN Wencheng,YUAN Huixiong,WEI Yuxia,PANG Yanfang,WANG Junli
【Abstract】 Objective To investigate correlation between male sterility of Zhuang nationality in western Guangxi and the single nucleotide polymorphisms at the rs1062577 locus of estrogen receptor α (ESRα) in Zhuang nationality.
Methods Case-control method was used for the study,and TaqMan probe real-time PCR technique was used to perform genotyping of ESRα loci in 96 infertile men aged 21~46 years(experimental group) and 83 normal healthy men aged 20~46 years (control group),and the method was verified by sequencing.In addition,distribution characteristics of genotype and allele frequency in the experimental group and the control group was counted by SPSS software.
Results Compared with wild homozygous genotype,heterozygous genotype and homozygous mutants genotype showed no correlation with male infertility,and it also showed no correlation in the comparison between mutant allele and wild allele(P>0.05).Gene polymorphism of ESRα was not correlated with sperm concentration,the percentage of forward motile sperm and normal sperm morphology.
Conclusion Single nucleotide polymorphisms at the rs1062577 locus of ESRα is not correlated with male infertility in Zhuang nationality.
【Key words】 ESRα;male infertility;gene polymorphism;correlation analysis
根據世界卫生组织(WHO)的标准,男性因素在降低人类生育能力中起着至关重要的作用[1]。近年来研究发现,雌激素受体α(estrogen receptor α,ESRα)大量存在于人类生殖组织,其基因多态性与各种疾病,也包括有关人类不孕,在基因型和人类生殖行为之间表现出复杂的相互作用[2]。目前认为造成男性不育最主要的因素为环境和遗传因素,其中既常见又重要的因素是基因突变。因此研究参与男性精子发生基因的多态性成为该邻域的研究热点。本研究对ESRα基因rs1062577位点进行基因多态性分析,阐述该位点基因多态性与广西壮族男性不育之间的相关性。
1.1 研究对象
收集2016年10月至2017年3月就诊于右江民族医学院附属医院生殖中心患者,此次研究对象均为广西壮族男性,年龄21~46(31.05±5.83)岁,临床表现为不育症者96例,患者主诉婚后1年以上不育,有发育良好的第二性征和正常的睾丸体积,排除女方的因素。在进行试验组收集时,参照《WHO人类精液检查与处理实验室手册》第5版诊断标准[3]:精子密度的参考值下限为15×106/ml,总运动精子比例的参考值下限为40%,前向运动精子比例的参考值下限为32%,正常形态精子比例的参考值下限为4%;同时记录患者年龄、民族、籍贯、生育史及家族史等基本情况。对照组为具有正常生育史的健康男性(83例),体格检查和精液质量分析均正常,排除炎症、生殖系统器质性病变等影响生育能力疾病的患者,年龄20~45(32.40±6.31)岁,本研究获得右江民族医学院附属医院医学伦理委员会审核通过且患者知情同意。
1.2 实验方法
1.2.1 精液质量检测
所有检测对象标本采集时使用手淫取精法,取精前禁欲2~7天,收集于带刻度的、清洁干燥试管内,所有标本均于本院取精室内采取,确保送检时间的可控性和及时性。接收时立即放入37℃恒温箱内,并记录标本采集时间。精液常规检测采用西班牙SCA全自动精液分析系统,光学显微镜为OLYMPUS(日本,CX41-32C02),完成常规检测后标本进行Diff-Quik快速染色(参照《WHO人类精液检查与处理实验室手册》第5版诊断标准)[3]。
1.2.2 外周血 DNA的提取
采用EDTA-K2抗凝真空采血管抽取外周血3 ml,按照天根生物科技有限公司DNA提取试剂盒说明书提取DNA,采用紫外分光光度仪检测所提取的DNA浓度和纯度,存放于-80℃冰箱中保存备用。
1.2.3 ESRα基因分型检测
PCR扩增:总反应体系体积20 μL,其中模板DNA 5 μL(终浓度1 μg/μL)、双蒸水4.5 μL、基因分型混合物0.5 μL、FastStart Essential DNA探针预混物10 μL。应用罗氏LightCycler 480实时荧光定量PCR仪进行基因扩增。反应条件为95℃预孵育600 s;两步放大:95℃ 15 s,60℃ 60 s(单次采集),共40个循环;冷却:37℃ 30 s,最后4℃保存;荧光通道为FAM/VIC。设置无模板质控孔。
1.3 统计学方法
数据用SPSS 17.0软件进行统计分析,对基因型和等位基因的频率分布进行χ2检验,计量资料若服从正态分布用(±s)表示,组间比较采用t检验或方差分析,若不服从正态分布,则用M(P25,P75)表示,组间比较采用非参数秩和检验;基因多态性与男性不育的风险关系采用比值比(odds radio,OR)及其95%可信区间(confidenceinterval,CI)来描述。使用在线分析工具计算试验组和对照组哈德温伯格平衡值(HWE),检验水准:α=0.05,双侧检验。
2.1 群体代表性检验
对对照组基因型进行哈德温伯格平衡检验,P=0.139,说明研究对象来自同一群体,具有较好的代表性;年龄分布、禁欲时间和精液体积在两组中差异无统计学意义(P>0.05),两组患者的前向运动精子百分率和精子浓度差异有统计学意义(P<0.01)。各项基本资料见表1。
2.2 ESRα rs1062577等位基因频率和基因型分布
采用χ2 检验对ESRα rs1062577等位基因分布频率和基因型频率进行分析,等位基因T、A分布频率在两组间差异无统计学意义(P>0.05)。经检测该位点有三种基因型TT、AT、AA,其分布频率在两组间差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表2。
2.3 ESRα基因SNP 突变的测序分析
为进一步验证基因分型结果的准确性,我们随机选取ESRα位点的三种基因型个体的样本送至上海生工生物工程有限公司进行序列测定,测序结果与TaqMan探针方法得到的结果一致。详细结果见图1。
2.4 ESRα基因型间精液质量的分析比较
采用多个样本比较非参数Krukal-Wallis H检验不同基因型与精液常规参数的关系。结果显示,rs1062577位点三种基因型间(TT/AT/AA)精液体积、精子浓度、前向运动精子百分比及正常精子形态百分比差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表3。
近年来的研究表明[4],ESRα在精子发生的早期和生精细胞成熟的晚期发挥着生理功能,与精液质量有着密切关系,其遗传多态性影响疾病的发生发展,雌激素受体在生殖系统中的研究逐渐成为关注的焦点。雌激素一直被认为是男性生殖的保护因子,但有研究表明[5~6],雌激素减少可影响睾丸间质细胞分泌睾酮,降低睾丸支持细胞的数量,干扰胎儿睾丸间质细胞的发育,调控生殖细胞的凋亡。E2通过ESRα信号能够促进间质细胞畸形生长和巨噬细胞活化,刺激间质细胞产生生长停滞基因6(GAS6),连接细胞表面暴露的磷脂酰丝氨酸(PS),调节凋亡细胞的吞噬作用[7]。已有研究证实ESRα基因rs1062577位点与多种癌症的易感性有关[8~9],但其与男性不育的相关性鲜有报道。本研究结果显示:ESRα基因rs1062577位点的等位基因频率和基因型分布在试验组和对照组之间没有差异(P>0.05),由此可以推测ESRα基因rs1062577位点与广西壮族男性不育不存在相关性。
雌激素受体激活细胞周期和转录因子的细胞内信号通路,调节睾丸支持细胞增殖和分化,对建立血-睾屏障,维持精子发生的能力具有重要作用[10]。有学者推测[11],ESRα基因发生突变可以使雌激素对生精细胞的作用减弱,可能是由于遗传的连锁不平衡效应改变了基因的表达与功能,影响mRNA的合成、拼接、成熟、转运、翻译和降解过程,间接影响了精子发生。ESRα广泛分布于雄性生殖系统内,对生殖功能有一定影响,通过对ESRα敲除和敲入小鼠的研究发现,主要通过配体依赖和非依赖途径影响精子的发生和成熟,尤其是在輸出小管液体重吸收方面起到重要的调节作用[12]。已证实在使用ESRα激动剂治疗后精子数目减少,这与ESRα激动剂能够阻滞精子的变形,下调参与精子发生的基因有关[13]。Lazaros等[14]也发现,ESRα与精子发生过程和精子质量有关,影响精子的动力和浓度。本研究中,ESRα rs1062577 位点基因多态性与精子浓度、前向运动精子百分比及正常精子形态百分比无相关性,可能是壮族与其他民族间存在差异,因而造成男性不育易感性差异[15]。
综上所述,ESRα rs1062577与男性不育之间无关联,但为广西人群疾病遗传多态性的研究提供参考资料。本研究仅收集广西地区壮族为研究对象,且存在标本量较少。因此,在研究的同时应对本地区、不同种族进行多位点、大样本量的深入细致分析。
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