水产品特定腐败菌群体感应及其植物源抑制剂研究进展

蓝蔚青 王 蒙 陈梦玲 谢 晶

(1. 上海海洋大学食品学院，上海 201306；2. 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306； 3. 上海冷链装备性能与节能评价专业技术服务平台，上海 201306； 4. 食品科学与工程国家级实验教学示范中心﹝上海海洋大学﹞，上海 201306)

水产品肉质细腻，口感较好，是人类重要的动物蛋白源，受到消费者青睐。然而，由于其肌肉组织柔软，水分、不饱和脂肪酸与可溶性蛋白含量高，同时从捕捞至加工销售过程中易受污染，发生腐败[1]。相关报道[2]显示，微生物活动是引起水产品腐败变质的主因，其中腐败菌为关键“贡献者”。

由于水产品的加工贮藏条件差异较大，不同水产品均有其特定的微生物类型，且只有部分微生物参与腐败过程，并逐渐占主导地位，这些微生物就是其特定腐败菌(Specific Spoilage Organisms, SSO)[3]。特定腐败菌繁殖速度快，产生腐败代谢产物能力强，甚至会拮抗其它细菌的生长。通常情况下，水产品的机体组织内部无菌，但其在捕捞、加工与流通等过程中会被微生物污染，大黄鱼、罗非鱼、大菱鲆、鲈鱼、凡纳滨对虾与虹鳟鱼等水产品中的SSO多为革兰氏阴性菌[4]。同时，贮藏与加工方法不同，其优势腐败菌也存在差异。研究[5]表明，以腐败希瓦氏菌等为主的SSO数量及种类同水产品货架期显著关联。可见，开展特定腐败菌群体感应研究有利于水产品低温流通与加工方法优化密切相关。

近年来，部分研究[6-8]表明，群体感应现象在各类食品变质过程中被发现，腐败菌作用与群体感应密不可分。随着对水产品中的微生物群体感应机制与其腐败间相关性研究的不断深入，群体感应系统参与微生物活动的调控机制也得到不断完善。因此，研究群体感应现象，对于靶向抑菌与提升水产品品质方面具有重要的经济效益与社会价值。群体感应(Quorum sensing, QS)是细胞交流的重要方式之一，是菌体细胞间的通讯机制，通常与菌体细胞密度有关。许多细菌能产生、分泌应答信号分子，当信号分子浓度达到阈值浓度时，细菌就会检测到其存在并与受体结合，导致生物发光、毒性因子分泌、生物膜形成和抗生素合成等基因的表达[9-10]。其中，FUQUA等[11]定义了细菌群体感应现象的产生与积累产生细菌反应化学信号的现象有关，群体感应现象还先后在弧菌、农杆菌、铜绿假单胞菌与胡萝卜软腐欧文氏菌等微生物有机体中被发现。本文拟从水产品中群体感应的自诱导分子、群体感应机制研究动态、抑制剂的分类与作用机理、存在问题等方面进行分析，以期为水产品贮藏保鲜提供参考。

1 水产品中群体感应自诱导分子(Autoinducers, AIs)

群体感应通过细胞信号分子进行沟通，随着细菌种群密度的增加，化学信号分子在环境中积累。大多数细菌可产生、释放、检测并响应化学信号分子而协调细菌群体行为，这些信号分子也称自诱导分子[12]。群体感应系统有AI、受体和受体蛋白3个基本组成。目前，群体感应研究主要从AI入手，根据AI的性质与感应模式不同，可将细菌QS系统分为不同类型，如存在于革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及两者皆存在的现象。目前水产品QS系统中研究较多的信号分子主要有AI-1、AI-2、DKPs、AIPs与其他信号分子等。

1.1 AI-1

AI-1即N-酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactones, AHLs)，为革兰氏阴性菌中主要的自诱导因子。AHLs类自诱导因子种类较多，但均具有共同的高丝氨酸内酯环结构，所有AHLs的特异性都由其酰基侧链的碳链长度和第3个羰基碳取代基团决定[13]。最初，Asad等[14]在海洋费氏弧菌发光现象的研究中发现了由AHLs调控的群体感应LuxI/LuxR系统模式。其中，LuxI蛋白是自诱导物合成酶，催化生成AHLs信号分子。一般短链的AHLs分子扩散至细胞膜外，长链的AHLs通过内吞和外排作用进出细胞[15]。当浓度达到阈值时，其与LuxR转录因子结合，形成LuxI/LuxR蛋白复合体，调控目标基因的转录[16]。此外，在哈氏弧菌中发现LuxM蛋白也是AHLs生物合成的来源，此类AHLs类信号分子称HAI-1。LuxM合成HAI-1后，结合传感器激酶LuxN进行基因表达调控[17-18]。研究人员[19]对铜绿假单胞菌的群体感应系统研究最多且最深入，得出其分别由4个相互连接的信号机制组成多层结构。其中LasI/LasR-RhlI/RhlR系统由2对LuxI/LuxR同源物被识别为LasI/LasR和RhlI/RhlR。LasI和RhlI是自诱导合成酶，产生3-oxo-C12-HSL和C4-HSL 2种AHLs分子，分别与转录因子LasR、RhlR结合，LasR/AI复合物激活RhlI与RhlR调控相应的毒力基因表达[20-21]。

1.2 AI-2

AI-2是一类呋喃硼酸二酯类化合物，为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均可产生的自诱导因子，介导细菌种间交流。AI-2可通过外源感知和内源合成方式获得，前者发生在无AHL合酶但含LuxR的微生物中，其未编码AI-2合成蛋白的luxS同系物却具有AI-2受体以感知外源AI-2[22]；后者存在2种合成途径，常规路线为：AI-2合成源于S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine, SAM)的代谢途径，当SAM的甲基移至底物后，生成S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosyl homocysteine, SAH)，SAH被S-腺苷同型半胱氨酸核苷酶(S-adenosyl homocysteine nucleosidase, Pfs)迅速降解，产生S-核糖同型半胱氨酸(S-ribose homocysteine, SRH)，再由LuxS酶降解为4,5-二羟基-2,3-戊二酮(DPD)和高半胱氨酸。DPD环化后形成具有活性的AI-2并被输出胞外[23]。另一种途径中只有Pfs没有LuxS，使用SAH水解酶将SAH水解成腺苷和高半胱氨酸，腺苷被Pfs转化成核糖-1-磷酸，经异构化为核糖-5-磷酸，再转化为DPD和AI-2[24]。因此也说明了LuxS对于AI-2合成不是必不可少的。现已发现3种AI-2受体，LuxP、LsrB和RbsB蛋白，其主要位于细胞内，由于AI-2在某些细菌中产生并被感知但不被内化，可认为某些AI-2受体位于细胞表面[25]。当AI-2在菌体外累积到一定阈值时，其会与受体蛋白LuxP结合，再与双组分蛋白LuxQ作用以引起生物发光，此也为哈氏弧菌检测AI-2的BAI-1型式[26]。可见，在QS信号分子的产生过程中微生物的代谢复杂，AI-2仍有待进一步探索。

1.3 DKPs

DKPs为二酮哌嗪类化合物(Diketopiperazines)，也称环二肽。近年来，DKPs被证明为新的信号分子[27]，在铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌与肠杆菌等革兰氏阴性菌的培养上清液中被检出，后续在与海洋无脊椎动物相关的一些细菌中被分离出[28-29]。其中，赵爱飞等[30]通过GC-MS在荧光假单胞菌和波罗的海希瓦氏菌检测到4种DKPs中主要种类是Cyclo-(L-Pro-L-Leu)和Cyclo-(L-Pro-L-Phe)；Zhu等[31]在大黄鱼冷藏过程中从分离出波罗的海希瓦氏菌和腐败希瓦氏菌检出DKPs信号分子，且通过外源添加AI-2、DKPs、AHLs三类信号分子研究其腐败表型的变化，证明DKPs可能调控大黄鱼腐败。DKPs类信号分子能与LuxR蛋白结合，促进或猝灭QS以控制基因表达，可视为部分代替AHLs作用[32]。DKPs介导QS系统的具体机制至今尚未完全明晰，且由DKP诱导的鱼类腐败作用和调控体系也无明确定义。

1.4 AIPs

AIPs是自诱导肽(Autoinducing Peptides)，由革兰氏阳性菌产生，以前体肽或自诱导肽的形式通过细胞核糖体合成，然后通过ATP结合盒(ATP-binding cassette, ABC)转运蛋白复合物对其进行加工修饰，将修饰肽运出细胞[33]。在一定AIP浓度下的双组分调控信号转导因子接收信号后，通过磷酸化将信息传递给细胞，激活相关基因，代表菌株为金黄色葡萄球菌[34]。在部分革兰氏阳性菌中，AIP也可被转运至细胞质中调控基因表达，如蜡样芽孢杆菌，成熟的AIP分子在细胞质中与转录因子结合，其复合物可调节蜡样芽孢杆菌毒力因子的产生[35]。类似于金黄色葡萄球菌的agrBDCA系统，研究发现乳酸菌具有同源性lamBDCA系统，且其通过组氨酸蛋白激酶(histidine protein kinase, HPK)和细胞质应答调节子(response regulator, RR)组成的双组分信号转导系统(Two-component signal transduction system, TCS)来调控菌体行为[36]。

1.5 其他信号分子

除上述4类主要信号分子外，细菌QS系统还有其他信号分子。其中，AI-3是一类调控肠道出血性埃希氏大肠杆菌毒力因子表达，介导致病菌与宿主细胞交流的信号分子，目前对此信号分子的结构和合成机制仍不明晰。研究[37]发现，多种共生细菌都能产生AI-3，也表明AI-3可能是另一种跨物种的QS信号分子。PQS(Pseudomonas Quinolone Signal)为2-庚基-3-羟基-4-喹诺酮，又称假单胞菌喹诺酮信号，是铜绿假单胞菌的第3种自诱导因子，其能调控基因表达，增强膜泡形成，在对氧化应激反应中表现为双重作用[38]。通过整合转录起始因子RpoS研究了PQS和QS转录调节因子VqsR之间的作用，得到PQS与VqsR间存在控制体系，且RpoS在其中发挥关键作用[39]。DSF(Diffusible signal factor)为脂肪酸类化合物，被发现存在于不同的革兰氏阴性菌中[40-41]。现发现一种DSF翻转及其调控机制，其为理解DSF依赖微生物调控病毒基因表达，以应对周围环境变化提供了新的维度[42]。事实上，一些细菌不产生自诱导物，却可响应其他细菌的自诱导物产生信号。如大肠杆菌响应来自其他细菌的信号SdiA[43]，洋葱伯克霍尔德菌也已被证明对铜绿假单胞菌产生的QS信号有响应[44]。此外，真菌的毒力和生物膜形成也受到QS的调控。白色念珠菌中法尼醇的发现是QS在真核生物中的显着突破，其产生的信号分子将酵母细胞转化成菌丝体而调控毒性因子的表达[45]。目前已确定一些真菌传播的重要化合物，但其实际机制未明确[46]。

2 群体感应抑制剂(quorum sensing inhibitor, QSI)

由于水产品中的腐败菌活动受群体感应机制调节，因此阻断群体感应过程为开发新型保鲜剂提供了新思路[47]。水产品除应配合不同的贮藏方式，更应对症下药，在群体感应进程中，将信号分子在产生、扩散、感应与基因表达处切断，从而改善其品质，延长货架期。将天然或合成的能阻断群体感应信号分子发挥作用或受体识别信号分子的识别过程，而不干扰细菌正常生理活动的化学活性物质称为群体感应抑制剂[48]。

2.1 QSI的分类与作用机制

群体感应抑制剂的来源广泛，一般可分为天然和合成抑制剂，天然抑制剂又可分为植物、动物及真菌次级代谢产物。出于水产品保鲜的安全性考虑，相关学者[49-50]主要开展了天然抑制剂作为水产品特定腐败菌群体感应抑制剂的研究。

目前有抑制信号产生、信号扩散与信号接收等方式可干扰或中断细菌的QS系统[51]。其作用机制主要有：① 利用一些小分子物质减少信号分子的产生，使QS系统停止继续发挥作用。如一些QS淬灭酶可通过抑制信号分子合成酶的活性来抑制细菌群体感应系统。有研究[52]显示，Lon蛋白酶可降解信号分子合成酶来影响AHLs合成，抑制弧菌的LuxR/LuxI型QS系统。② 使用降解酶以促进群体感应信号分子的降解。研究[53]发现，在细菌中存在较多AHLs的QS淬灭酶，如酰基转移酶和内酯酶。Kim等[54]得出，对氧磷酶-2(PON2)可水解3-oxo-C12-HSL信号分子以抑制铜绿假单胞菌的QS系统。③ 利用信号分子类似物竞争受体蛋白以阻断信号接收。如合成分子——吡哆醛乳酰腙，研究发现其可与LasR的多个活性位点接合以抑制铜绿假单胞菌中QS相关毒力因子的表达，可用于开发新型抗菌剂[55]。目前这种作用机制也是药物筛选的理想靶点[56]。

2.2 植物源QSI在水产品中的应用

目前研究较广泛的是植物源天然抑制剂。一些从植物中提取的化合物长期以来被用作传统医学，且经证实生物性质天然物质的种类数量仍在不断增加。具有抗菌活性的主要植物化合物有酚、醌、皂苷、单宁、香豆素、萜与生物碱类等[57-58]。其中，丁香酚具有良好的抗铜绿假单胞菌的las群体感应系统与抗紫色色杆菌QS活性[59]。异柠檬酸可干扰哈氏弧菌中细胞信号传导与生物膜的形成[60]。肉桂醛及衍生物可降低大肠杆菌生物膜的形成及不同弧菌属中AI-2介导的QS，表型变化明显[61-62]。

近年来，在健康新理念的驱动下，将植物提取物用于水产品相关特定腐败菌群体感应抑制研究得到广泛关注。该抑制剂既解决了细菌耐药性问题，也能避免使用其他来源的抑制剂带来的副作用，更能满足人们的健康需求。现有研究[47]表明，许多水果、蔬菜、香草和香料具有抗QS活性。同时，由于其提取物毒副作用小或几乎无毒副作用而逐渐被用作QSI[50,63]。现此类QSI的研究已成为热点，Kamila等[64]发现百里香精油及主要生物活性化合物能明显抑制荧光假单胞菌KM121的运动性及生物膜形成能力。Banerjee等[65]发现穿心莲氯仿提取物能明显降低铜绿假单胞菌lasI、lasR、rhIL和rhIL的表达，使其巨噬细胞中的MAPK信号转导途径明显削弱。Liu等[66]证明柚皮黄酮提取物对海洋性致病菌鳗弧菌存在QS抑制性。

3 存在问题与解决措施

3.1 植物样本间存在个体差异

植物除在地域、种类与生长阶段上存在差异，某些植物源提取物对紫色杆菌和铜绿假单胞菌的QS活性有增强作用，表明其可产生改变基于细菌AHL信号传导系统的化合物[50]。

3.2 天然提取物的毒性尚未明确

部分植物虽具有较长的食用与药用历史，但其提取物的安全性仍无法保证。目前对其提取物的安全性研究相对较少。但已有学者[67]证实其在食品中的使用是安全的。然而实际上，如无致命影响尚不能证明植物制剂对基因毒性的安全性，其可能存在慢性毒性的影响，甚至毒性因人群个体差异性而被放大。

3.3 提取物的QS作用机制尚不深入

目前有研究[68]报道了膳食植物提取物或其有效成分具有干扰种内或种间QS的能力，但未能深入到其作用机制研究。同时，研究[69]表明植物提取物及其化学活性物质的作用发挥具有特异性，由于其难以由一个系统移至另一个系统，须在特定QS系统中选择。即使系统使用相同的AHL，在一个QS系统中选择的QSI在其他系统中也不能作为QSI[70]。

3.4 修饰后的天然生物活性化合物存在限制作用

对天然来源的生物活性化合物进行化学修饰是药物开发中的有效方法[71]。同样，可将天然植物的活性成分结合手性分子以合成新的QSI，其结构与AHL结构相似，通过与相应受体蛋白位点结合，达到抑制QS反应进程，但其受体位点可能与AHL信号结合腔的位置不同而未能发挥预测作用[55]。

因此，在对部分天然植物源抑制剂改进提取方式，提升提取率的同时，还应考虑提取剂对活性成分作用的影响。同时，应进一步开展对天然植物提取物的安全性研究，研究其急性和亚急性毒性。再次，不同细菌的QS调控表型存在差异，可将部分典型细菌作为QSI筛选模式菌株，快速筛选QS抑制因子，再结合高通量筛选技术以筛选得到优质QSI。最后，将提取物有效成分用于新型化合物的合成，并根据群体感应筛选模型结合基因芯片、逆转录—聚合酶链反应与计算机辅助模拟药物设计等方式，从而获得较优QSI。

4 结论

随着科研人员对水产品研究的不断深入，特定腐败菌的群体感应作用机制逐渐得到完善，其为获得优质的水产品保鲜剂提供了理论依据。从安全与健康方面考虑，水产品QSI的来源多倾向于天然植物。其中，对人体有益的植物资源因其能产生群体感应抑制作用而得到国内外密切关注。目前，对于群体感应抑制机制的研究还处于初级阶段，如何深入研究QSI作用于一种或多种QS系统的控制位点仍有待进一步研究。因此，结合多种新型技术以全面研究QSI作用机制将会逐步实现。此外，基于当前研究现状，可逆向思维，对需要控制的目标QS系统寻找新QSI而展开研究。