油菜蜂花粉中抗前列腺增生的活性成分

达热卓玛， 饶 剑， 徐德平

（江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122）

良性前列腺增生（BPH）多发于老年男性身上，目前发病率呈逐年上升趋势[1]。目前应用于临床治疗BPH的药物主要为：α1-受体拮抗剂、5α-还原酶抑制剂、生长因子抑制剂和天然植物提取物类药物制剂等[2-7]。国际上最常用于治疗BPH的天然产物类药物制剂有瑞典的舍尼通，主要成分为花粉提取物，它的药效物质基础和作用机制均已明确，服用剂量相对更小，但未对外公布[8-10]；国内常用药物为前列康，是一种油菜蜂花粉片，有明确治疗效果，但药效物质基础与作用机制均未阐明，造成服用剂量大，治疗周期长等缺陷。作者的研究目的就是明确油菜蜂花粉中抗BPH的药效物质基础，为BPH的治疗提供理论基础。

1 材料与设备

1.1 材料

油菜蜂花粉：购于青海门源；雄性昆明小白鼠：清洁级，饲养环境为屏障环境，许可证号为SYXK（苏）2012-0002：上海斯莱克实验动物有限公司提供；丙酸睾酮注射液：上海通用药业股份有限公司产品；舍尼通：南京美瑞制药厂产品；前列腺酸性磷酸酶（PAP）试剂盒、睾酮（T）试剂盒、雌二醇（E2）试剂盒、二氢睾酮（DHT）试剂盒：上海江莱生物科技有限公司产品。

1.2 仪器与设备

Brucker AVance500MHz核磁共振仪：中科院上海有机化学研究所产品；R-1002型旋转蒸发仪：上海申科生物科技有限公司产品；SHZ-95型循环水式多用真空泵：上海丞明仪器设备有限公司产品；Waters-600型高效液相色谱仪：美国 Waters公司产品；AB204-N精密电子天平：Mettler-Toledo Group产品；5840R型冷冻离心机，Eppendor公司产品；MULTISKANMK3酶标仪：美国Thermo公司产品。

2 实验方法

2.1 样品处理

称取100 kg油菜蜂花粉，粉碎过80目筛，分10批提取，每次取10 kg加入100 L萃取罐中，以料液质量体积比 1 g∶7 mL加入体积分数为 90%乙醇，室温提取3 h，过滤得滤液，滤渣再按上述方法重复提取2次，合并滤液，减压浓缩，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，低温浓缩至膏状，得到乙酸乙酯萃取物（B）、正丁醇萃取物（C）以及萃余物（D）3 个部分，置于冰箱低温保存备用。

2.2 油菜蜂花粉各萃取物抗BPH活性研究

2.2.1 建立动物模型 根据文献[11-13]复制BPH模型，选取120只雄性昆明小鼠，6周龄，体重20～25 g，适应性饲养1周，编号后随机分成12组，每组10只。大豆油稀释TP注射液后密封备用，舍尼通阳性组、模型组和实验组小鼠每日皮下注射5 mg/kg的TP稀释液，连续造模30 d，建立小鼠BPH模型，正常对照组小鼠每日皮下注射等体积大豆油。造模同时，各实验组小鼠分别每日按量灌胃各萃取物的混悬液。舍尼通阳性组小鼠每日灌胃舍尼通水溶混悬液200 mg/（kg·d）。模型组和正常对照组小鼠每日灌胃等体积生理盐水，用量均为0.01 mL/g，连续灌胃30 d。

2.2.2 生化指标测定 末次给药24 h后，眼球取血，断颈处死，取前列腺组织，在生理盐水中洗去组织上的残血，然后用滤纸吸干，用精密分析天平称质量，计算器脏指数。血液4℃条件静置30 min，3 000 r/min离心15 min，取上清液。用Elisa试剂盒测定小鼠血清中PAP活力、T、E2和DHT的含量等理化指标。利用Excel、SPSS6.0等统计分析软件处理，实验结果见表1。

表1 各萃取物对BPH模型小鼠前列腺湿重、指数、血清DHT 的影响（X±s，n=10）Table 1 Effects of every extraction on the wet weight index and serum DHT of mice with BPH （X±s，n=10）

2.2.3 分离、纯化与结构鉴定 将有活性的乙酸乙酯萃取物悬液上样MCI色谱柱（10×150 cm），经去离子水、体积分数为 30%、50%、70%、95%的乙醇进行梯度洗脱，得到PI、PII、PIII。经ODS-B反相柱（5×150 cm）， 依次用体积分数为 30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%的乙醇洗脱，TLC 跟踪检测[14]，根据薄层板上Rf值和显色颜色差异将洗脱液分为A、B、C、D、E、F 6 个部分。 根据分离检测结果选用ODS-A反相色谱柱细分，得到相应的单体化合物1、2、3、4、5、6。

以DMSO-d6和Pyr为溶剂，四甲基硅烷（TMS）为内标物，通过1H-NMR、13C-NMR和135DEPT-NMR分析数据信息，结合文献确定其化学结构。

3 结果与讨论

3.1 各萃取物对BPH模型小鼠的影响

3.1.1 各萃取物对BPH模型小鼠前列腺湿质量、指数、血清DHT的影响 各组小鼠血清中T、E2和PAP的测定结果如表2。其中A表示舍尼通，B表示乙酸乙酯，C表示正丁醇，D表示萃余物。

由表1可看出，模型组小鼠与空白对照组相比，前列腺湿质量和前列腺指数普遍显著增加（P<0.01），表明模型组小鼠前列腺出现了明显的增生症状，即说明造模成功；模型组小鼠血清DHT含量显著升高（P<0.01），表明雄激素诱导法可以成功复制出小鼠BPH模型。与模型组相比，舍尼通阳性组小鼠的前列腺湿质量明显减小（P<0.05），前列腺指数显著下降（P<0.01），小鼠的血清DHT水平也显著下降（P<0.01），说明阳性药物舍尼通对 BPH模型小鼠有明显的抑制作用；乙酸乙酯萃取物高、中剂量组和正丁醇萃取物高剂量组和萃余物高剂量组均可明显降低BPH模型组小鼠前列腺湿质量（P<0.05）；乙酸乙酯萃取物高、中剂量组模型小鼠的前列腺指数显著下降（P<0.01），乙酸乙酯萃取物低剂量组可明显降低BPH模型小鼠前列腺指数（P<0.05）；乙酸乙酯萃取物高、中、低剂量组均可非常显著的降低模型小鼠血清DHT含量 （P<0.01），DHT作为前列腺中活性比T更强的主要雄性激素，DHT含量升高可直接导致BPH。相反，DHT含量的显著降低，可明显抑制BPH。实验结果表明，舍尼通，乙酸乙酯萃取物能有效抑制雄激素诱导BPH模型小鼠的前列腺增生，同时还能降低模型小鼠DHT含量的作用。其中乙酸乙酯萃取物抗BPH活性最为明显。

3.1.2 各萃取物对 BPH模型小鼠血清 T、E2和PAP的影响 各组小鼠血清中T、E2和PAP的测定结果如表2。

表2 各萃取物对BPH模型小鼠血清T、E2和PAP的影响（X±s，n=10）Table 2 Effects of PI，PII，PIII on the serum T、E2and PAP of mice with BPH（X±s，n=10）

模型组小鼠较空白组小鼠血清中T、E2含量显著升高（P<0.01），PAP 活力同样显著提升（P<0.01），说明模型成功。与模型组相比，舍尼通阳性组、乙酸乙酯萃取物高、中、低剂量组、正丁醇萃取物高剂量组模型小鼠血清中T含量显著地下降 （P<0.01），萃余物高剂量组T含量明显减少（P<0.05），可使由T经5α-还原酶转化而来的DHT的含量相应减少，从而抑制 BPH；舍尼通阳性组和乙酸乙酯萃取物高剂量组模型小鼠血清E2含量显著下将（P<0.01），乙酸乙酯萃取物中、低剂量组使BPH模型小鼠血清中E2含量明显下降（P<0.05），雌激素含量下降对抑制BPH有重要作用，它可明显减少前列腺组织胞液中雄激素DHT受体的含量，从而实现其抗BPH活性；舍尼通阳性组和乙酸乙酯萃取物高、中、低剂量组均可明显的降低模型小鼠血清中PAP的酶活力（P<0.01），正丁醇萃取物高、中剂量组及萃余物中剂量组在降低模型小鼠血清 PAP酶活方面效果明显（P<0.05），PAP酶活明显降低说明模型小鼠的前列腺增生已经得到很好的抑制。结果表明，乙酸乙酯萃取物取能有效降低BPH小鼠的血清T、E2含量及PAP酶活力，从而实现抑制小鼠前列腺增生，其效果更显著；而正丁醇萃取物和萃余物整体效果不明显。

3.2 乙酸乙酯萃取物的分离与鉴定

由 2.2.3 实验方法得到化合物 1、2、3、4、5、6。

化合物1：呈淡黄色粉末，可溶于乙酸乙酯、乙醇等有机溶剂，在浓硫酸反应中显黄色，盐酸-镁粉反应中呈紫红色。

综合其理化性质、1H-NMR及13C-NMR图谱数据解析（详见表3-1），并参考文献中的数据[15-19]，可见该化合物共有21个碳，为黄酮类化合物，C-5、C-7、C-4＇上的 δ值分别为 161.2、164.2、159.9，说明该黄酮为山奈酚，分析得出化合物1为山奈酚-3-O-β-D吡喃葡萄糖苷。结构式见图3-2。

化合物 2：无色脂状物，易溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙醚等溶剂，在水中呈乳浊液，振摇起泡。

结合1H-NMR、13C-NMR碳谱数据（见表3-1）、推断该化合物具有α-亚麻酸链。经135DEPT谱推断有甘油结构，由NMR图谱和文献[20]比较得出化合物2为十八碳-9Z，12Z，15Z-三烯酸甘油酯。结构式见图3-2。

化合物3：无色脂状物，易溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙醚等溶剂，在水中呈乳浊液，振摇起泡但很快消失。

HPLC分析保留时间与化合物2的保留时间相近，可能与其结构也相近。13C-NMR的碳谱数据（表3-1）、135DEPT谱、HMBC谱判断与化合物 2具有相同的亚麻酸结构，参照文献[21，22]可推断该化合物为 3'-甲氧基-1'-十八碳-9Z，12 Z，15 Z三烯酸甘油酯，结构式见图3-2。

化合物4：黄色油状物，易溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙醚等溶剂，在水中呈乳浊液，振摇起泡但很快消失。

结合1H-NMR、13C-NMR 碳谱数据 （表3）、135DEPT-NMR谱，确定δ 72.6为1个叔碳信号，另外3个为仲碳信号。δ 14.9为甲基信号，δ 21.3～37.1共有10个仲碳信号。推断与化合物3类似，具有相同的亚麻酸结构。与文献[19，21]中N-乙基亚麻酸链相似。推断化合物为十八碳-9Z，12Z，15Z-三烯酰基-N-乙基甘油醚。结构式见图3-2。

化合物5：无色脂状物，易溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙醚等溶剂，在水中呈乳浊液，振摇起泡但很快消失。

1H-NMR和13C-NMR碳谱数据显示该化合物含有2个多不饱和脂肪酸链，δ126.9～131.4之间有6个碳信号，为对称结构2重碳信号，含有2个亚麻酸链。结合135DEPT、谱及文献[21]推断化合物为2'-甲氧基-1'，3'-十八碳-9Z，12Z，15Z-三烯酸甘油二酯，结构见图3-2。

表313C-NMR数据Table 313C-NMR spectroscopic data

化合物6：无色油状物，可溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙醚等溶剂。

图1 化合物 1、2、3、4、5、6 的结构式Fig.1 Structure of compound 1、2、3、4、5、6

综合13C-NMR谱（见表3-1）、1H-NMR、135DEPT-NMR信息分析，可知化合物有18个碳，未见CH信号，表示该化合物中不含支链结构。综上所述并参照文献[19，21]可知化合物为α-亚麻酸。结构如图3-2

4 结 语

探讨了油菜蜂花粉不同萃取物抗BPH活性的强弱，其中乙酸乙酯萃取物具有更明显的抗BPH活性。将其继续分离纯化得到1个黄酮类化合物和5个长链不饱和脂肪酸类物质。已证实不饱和脂肪酸是构成前列腺素前提物质的重要组成物质，而黄酮抗BPH作用未见报道。推测长链不饱和脂肪酸类物质是油菜蜂花粉治疗BPH作用的物质基础。目前，油菜蜂花粉等天然产物制剂治疗BPH是一个重要的发展趋势，作者为研发更具针对性，效果更好，毒副作用更少的蜂花粉制剂提供了一定的理论依据。

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本研究利用所建立的指标体系和评价方法，从东营市5个系统，定量分析了东营市2007—2016年绿色经济发展的综合水平。2007—2016年东营市绿色经济发展综合得分见表2和图2。

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