光谱法及分子模拟分析大豆皂苷II与牛血清白蛋白的相互作用

光翠娥， 桑尚源， 干建平， 林 芳， 李志刚

（1.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡 214122；2.黄冈师范学院 经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室/大别山特色资源开发湖北省协同创新中心，湖北 黄冈438000）

大豆皂苷Ⅱ是一种五环三萜类齐墩果酸型单糖链皂苷，由非极性三萜苷元B的C-3羟基和极性三聚糖分子环状半缩醛上的羟基失水缩合而成，见图1。大豆皂苷Ⅱ是豆制品中皂苷的主要存在形式之一，已被发现具有促甲状腺分泌（保护肝脏）、抑制肾素活性（降低血压）、抗HSV-1疱疹病毒以及增强免疫原性（免疫佐剂）的功能[1]。

牛血清白蛋白（BSA）由582个氨基酸组成，其中包含两个色氨酸（Trp134和Trp212）和16个酪氨酸残基，因此具有荧光活性。BSA的三维结构类似于球状，由3个相似的结构域I、II和III组成，每一个结构域又由A和B两个亚结构域组成。BSA的亚结构域以槽口相对的方式形成圆筒状结构，疏水性氨基酸大多包埋于圆筒内部，构成疏水腔[2]。

BSA是哺乳动物血浆中的主要载体蛋白，具有储存和转运外源性小分子的重要功能。生理活性物质吸收进入体内后，由血清白蛋白通过各种生理膜运输到各组织器官，两者之间结合率与结合能力的不同，会影响到活性物质的作用强度和作用时间[2]。实验选用与人血清白蛋白结构相似、价格便宜、更易提纯的BSA，通过荧光光谱、圆二色光谱及分子模拟等研究活性小分子和BSA相互作用，为大豆皂苷Ⅱ的生物利用提供理论基础。

图1 大豆皂苷Ⅱ的化学结构Fig.1 Chemical structure of soyasaponinⅡ

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆皂苷Ⅱ（纯度91.7%）：美国ChromaDex公司产品；BSA：Sigma公司产品；三羟甲基氨甲烷（Tris）：国药集团试剂公司产品。Tris-HCl缓冲液：500 mL的0.1 mol/L Tris溶液中加入约420 mL的0.1 mol/L的盐酸，调节pH至7.4，精确加入5.8 g氯化钠，定容至1 000 mL，4°C保存待用。

FLUORMAX-4荧光光谱仪：美国HORIBA公司产品；MOS-450 AF-CD圆二色光谱仪：法国Bio-Logic公司产品；软件 Discover Studio（DS）2.5、LigPlot+分析软件：美国Accelrys软件公司产品。

1.2 方法

1.2.1 BSA的内源荧光光谱检测 用Tris缓冲液配制BSA与大豆皂苷Ⅱ不同比例的混合液。BSA的最终浓度为1 μmol/L，大豆皂苷Ⅱ的终浓度分别为0、0.5、1、2、4 μmol/L， 混合静置 30 min。 分别吸取200 μL Tris-HCl缓冲溶液 （pH 7.4）和样品注入2 mm比色皿中测定荧光光谱。室温下 （20℃），以295 nm为激发波长，狭缝为5 nm，在300～450 nm波长范围内扫描BSA样品的发射光得到内源荧光光谱图，重复扫描3次取平均值。空白为Tris-HCl缓冲溶液，荧光强度值为扣除空白后的相对值。

1.2.2 BSA的远紫外圆二色光谱检测 分别吸取200 μL Tris-HCl缓冲溶液 （pH 7.4）和样品注入2 mm比色皿中测定圆二色光谱，每次测量扣除Tris-HCl缓冲溶液的背景干扰。室温下（20℃）光谱测定条件是200～250 nm波长范围扫描，扫描速度为20 nm/min，响应时间为 2 s。

1.2.3 分子模拟 在蛋白质数据库 （PDB）中获取BSA晶体的三维结构模型数据文件 （登录号为3v03），使用DS2.5软件删除其中的配体小分子和水分子，补入缺失的氢原子，得到BSA晶体的完整三维结构。大豆皂苷Ⅱ的立体结构数据文件从网站www.chemical-book.com中搜索下载，采用PRODRG网 站 （http：//davapc1.bioch.dundee.ac.uk/cgi-bin/prodrg）对大豆皂苷Ⅱ的立体结构进行加电荷和构象优化等预处理。以BSA的Trp213残基为中心，半径为13×10-8cm的球体范围为对接区域，使用DS软件中的Libdock模块进行刚性分子对接。对接程序参数设置如下：Docking Tolerance，0.25；Numbers of Hotspots，100；Docking Preference，High Quality；Conformation Method，FAST；Parallel Processing，False。从大豆皂苷Ⅱ构象集中选取打分函数LibDockscore得分最高者，将其对接复合物的文件导入Ligplot+软件中，得到蛋白与皂苷分子间相互作用网，进一步分析得到氢键和疏水相互作用位点[3]。

2 结果与分析

2.1 不同浓度大豆皂苷Ⅱ对BSA稳态内源荧光光谱的影响

BSA有两个色氨酸残基，一个Trp213在疏水腔内部，另一个Trp134在亚结构域IB表面[4]。以295 nm为激发波长，BSA的内源荧光基团色氨酸产生发射荧光。蛋白质与小分子作用，色氨酸对微环境的变化敏感而使荧光光谱发生改变。在稳态内源荧光光谱图2中，单纯BSA在334 nm出现最大吸收峰，随着大豆皂苷Ⅱ的添加，最大发射波长略微蓝移至333 nm；在BSA与大豆皂苷Ⅱ比例为1∶1、1∶2和1∶4时，峰型不变，但出现荧光猝灭，BSA荧光谱特征峰的相对强度为98%、98%和97%。因此，大豆皂苷Ⅱ与BSA发生弱相互作用，使色氨酸残基的微环境的疏水性增加，蛋白质分子构象发生改变，形成了发射弱的荧光复合体。

2.2 不同浓度大豆皂苷Ⅱ对BSA圆二色光谱的影响

蛋白质生色团的光活性中心对平面圆偏振光中的左、右圆偏振光的吸收不同，造成透射后偏振光矢量的振幅差，圆偏振光变成椭圆偏振光，即为圆二色性，不同波长对应的椭圆率称为圆二色光谱，小于250 nm的远紫外区圆二色光谱反映蛋白质肽键的圆二色性[5]。在圆二色光谱图3中，靠近209 nm和221 nm处出现的两个负肩峰为单纯BSA分子α螺旋结构的特征峰，吸收峰的强度可以反映蛋白α螺旋的变化。随着大豆皂苷Ⅱ（特别是4倍的皂苷）的加入，BSA的圆二色光谱的负椭圆率下降，原209 nm处的负峰移向高波数并且振幅减弱，说明皂苷的疏水作用引起微构象的变化，使肽链伸展，改变了BSA的二级结构。

图2 不同浓度大豆皂苷Ⅱ对BSA内源荧光光谱的影响Fig.2 Fluorescencespectra ofBSA with different concentrations of soyasaponinⅡ

图3 大豆皂苷Ⅱ-BSA混合溶液的远紫外圆二色光谱图Fig.3 Far-UV CD spectra of the soyasaponin-BSA solutions

2.3 大豆皂苷Ⅱ与BSA相互作用的分子对接

DS工作站中Libdock模块的对接吻合度打分函数LibDockscore是对几何形状、化学环境以及能量的综合评价参数，也是根据配体与受体对接时的对接模式、亲和力和相对能量值等进行综合打分。LibDockscore大于100表示配体与受体能较好地结合，其值越大则表明对接产生的复合物构象越稳定，Poses是与配体受体蛋白对接时所得配体的构象数[3]。当大豆皂苷Ⅱ与BSA对接时，所得立体构象总数 Poses为 97，LibDockscore最高分为 188.485，表明两者可较好地稳定结合，所得复合物构象稳定。选取LibDockscore评分最高的构象，制作分子对接三维图。图4中，绿色为色氨酸残基，透明球中的线型模型分子为大豆皂苷Ⅱ的最优对接构象，由此可知皂苷处于“心型”BSA的疏水腔内。

2.4 大豆皂苷Ⅱ和BSA间的氢键和疏水相互作用

运用Ligplot+软件，得到最佳复合物分子间相互作用二维图，并通过HBPLUS程序计算氢键和疏水作用[6]。根据图5，表1总结了稳定的氢键作用，由此可知，BSA中的 4个氨基酸 Asp108、Asp111、Arg144及Arg458与大豆皂苷Ⅱ形成了6个氢键，其中Arg144与O46形成的氢键最短。同样地，从二维图5可知，BSA中的 15氨基酸 Ser109、Pro110、His145、Pro146、Leu189、Thr190、Ala193、Gln424、Ser428、Lys431、Val432、Arg435、Tyr451、Leu454 及 Ile455 参与了与大豆皂苷Ⅱ的疏水作用。

图4 大豆皂苷Ⅱ与BSA的对接三维图Fig.4 Molecular docking 3D-diagram of soyasaponinⅡand BSA

注：实心圆代表原子：红色为氧原子，黑色为碳原子，蓝色为氮原子。原子间的实线代表化学键：黄色为氨基酸残基的化学键，紫色为配体化学键。带标签的氨基酸代表BSA中与大豆皂苷Ⅱ相互作用的残基：红色并带有辐射状短线弧线的为参与疏水作用的残基，其它为参与氢键的残基，绿色虚线代表氢键作用。

根据以上相互作用的分析，使用DS工作站得到氢键和疏水相互作用的三维图。图6（a）中，大豆皂苷Ⅱ的三糖基链中第二个阿拉伯糖基、第三个鼠李糖基与BSA氨基酸残基有氢键作用。图6（b）中，参与疏水作用的氨基酸在BSA内部组成一个疏水性腔体（即代表静电中性点白色部分），大豆皂苷Ⅱ的疏水性配基齐墩果烷伸进BSA的这个疏水腔内，两者产生了疏水相互作用。

表1 大豆皂苷Ⅱ与BSA分子间氢键作用Table 1 Hydrogen bond interaction between soyasaponinⅡand BSA

图6 大豆皂苷Ⅱ与BSA分子间氢键和疏水作用三维图Fig.6 3D diagrams of hydrogen bond and hydrophobic interactions between soyasaponinⅡand BSA

3 结 语

通过内源荧光光谱、圆二色光谱和分子建模方法研究了大豆皂苷Ⅱ与BSA之间的相互作用。BSA的内源荧光光谱表明蛋白与大豆皂苷Ⅱ作用后其立体构象发生变化，圆二色光谱显示大豆皂苷Ⅱ还对BSA的二级结构产生影响。计算机模拟分子对接表明大豆皂苷Ⅱ与BSA的结合稳定性较好，大豆皂苷Ⅱ的三糖基链中阿拉伯糖基和鼠李糖基部分与BSA形成氢键作用，参与其中的重要氨基酸有Asp108、Asp111、Arg144和 Arg458残基， 皂苷的配基三萜烯部分与BSA的15个氨基酸残基形成疏水相互作用。这些研究阐明了大豆皂苷Ⅱ与BSA的结合特点，为进一步开发大豆皂苷提供了参考依据。

参考文献：

[1]GUANG Cuie，CHEN Jie，SANG Shangyuan，et al.Biological functionality of soyasaponins and soyasapogenols[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2014，62（33）：8247-8255.

[2]唐金艳.光谱法研究三种药物与BSA的相互作用[D].黄石：湖北师范学院，2011.

[3]ZHANG Hailing，GUANG Cuie，JIANG Bo，et al.Molecular docking of soyasaponin I and its analogues with renin and the analysis of binding energy[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2014，33（10）：1056-1062.（in Chinese）

[4]MAJOREK K A，POREBSKI P J，DAYAL A，et al.Structural and immunologic characterization of bovine，horse，and rabbit serum albumins[J].Molecular Immunology，2012，52（3-4）：174-182.

[5]SHEN Xingcan，LIANG Hong，HE Xiwen，et al.Recent trends and spectroscopic methods for analysis of the protein conformation with circular dichroism[J].Chinese Jounral of Analytical Chemistry，2004，32（3）：388-394.（in Chinese）

[6]LASKOWSKI R A，SWINDELLS M B.LigPlot+：Multiple ligand-protein interaction diagrams for drug discovery[J].Journal of Chemical Information and Modeling，2011，51（10）：2778-2786.