河南新乡地区汉族群体MMPs基因启动子区5个SNPs与CHF发病风险关联性研究*

张 倩 郭利伟 刘亚静 张咏鹤 徐光华 黄艳梅

(新乡医学院法医学院， 新乡 453003)

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一组可以参与到结缔组织的破坏与重构的酶家族。目前人们已经进行了大量关于MMPs基因多态性的研究，其中包括动脉粥样硬化、脑栓塞和肿瘤等，但关于心力衰竭(chronic heart failure,CHF)方面的研究比较少[1-2]。我们前期的研究工作发现，rs243866位点A等位基因可降低MMP-2转录活性，从而可以降低CHF的发生易感性[3]；而rs17576位点AG基因型可以引得精氨酸至谷氨酰胺的氨基酸变化，进而增加个体CHF发病风险[4]；此外，rs1799750位点的1G等位基因以及单体型1G6A会降低个体CHF发病风险[5]。虽然在人类的心肌组织中存在着多种MMPs,但当CHF发生时并不是每一种MMPs都会升高。我们查阅中国国际人类基因组单体型图计划(简称HapMap计划)数据库以及美国国立生物技术信息中心(NCBI)的dbSNP数据库又筛选出MMPs基因启动子区rs225207、rs2285053、rs243865、rs11225395及rs11568818 5个SNPs，探讨与CHF发病风险的关联性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择收治到新乡医学院第三附属医院的160例慢性CHF患者为观察组，其中男84例，女76例，年龄58～79岁，平均年龄(61.1±8.5)岁。以同期住院的非CHF心脏病患者(同时除去其患有感染性，血液性、肝肾功能不全、恶性肿瘤等疾病)186例为对照组，其中男97例，女89例，其年龄52岁～78岁，平均年龄(60.7±8.7)岁，所有对象知情同意并签署同意书，且均为三代以上居住在河南新乡地区。

1.2 主要仪器与试剂

凝胶成像分析系统(Bio-Rad公司，美国)、Qubit核酸蛋白定量分析试剂盒(Invitrogen生物公司)、PCR仪(Biometra公司，德国)、台式高速冷冻离心机(Eppendoff公司，德国)、Taq酶(上海生物工程有限公司)、SNPs位点扩增引物(Invitrogen生物公司)、多功能电泳仪(Phannacia公司，瑞典)、限制性内切酶Hinf I、Xsp I、EcoR I、BglⅡ。

1.3 方法

1.3.1资料收集 所有研究对象统一填写调查表，再由监督人员核验每一份调查表，确保信息无误。

1.3.2生化指标测定 空腹10 h过夜后，清晨6:00取受试者外周静脉血8 ml，其中3 ml用于血脂等生化指标测定、5 ml用于基因组DNA提取。采用现行标准化方法进行血生化指标检测，由新乡医学院第三附属医院检验科完成并进行质量控制。

1.3.3外周血基因组DNA的提取与定量分析 采用有机酚/氯仿法提取外周血基因组DNA，Qubit核酸蛋白定量分析试剂盒检测所提取DNA的质以及量，然后保存到-20℃冰箱备用。

1.3.45个SNPs目的片段PCR反应体系 包含10×Buffer，1.5mmol/L MgCl2， 0.2mmol/L dNTPs，10μmol/L引物，50ng～100ng DNA模版，1U Taq Plus DNA聚合酶，总体积共为25μl。热循环参数：95℃预变性2min后，94℃变性45s，退火温度变异范围(见表1)45s，72℃延伸45s，共计32个循环,最后72℃延伸10min。

表1 MMPs基因5个SNPs位点基本信息

1.3.55个SNPs等位基因及基因型分型 采用限制性内切酶片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)技术对SNPs进行分型。酶切反应总体系10：其中包含PCR扩增产物5.0，相应的内切酶1U，1×内切酶缓冲液，最后超纯水补充，然后37℃水浴16h；6%聚丙烯酰胺凝胶(polacryamide gel electrophoresis，PAGE)电泳检测酶切产物取3.0电泳上样，同时加入PCR扩增产物(未经酶切)以及500bp DNA Marker作为内参，恒压400V，1h(各SNPs所用限制性内切酶见表1)，硝酸银染色。

1.4 统计学方法

运用SHEsis软件比较每个SNP点在观察组与对照组间频率以及频数分布，OR和95%可信区间(95%CI)、样本的群体代表性应用Hardy-Weinberg平衡表示，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MMPs基因型分布Hardy-Weinberg平衡

MMPs基因启动区5个SNP位点各基因型在对照组中Hardy-Weinberg平衡结果表明，rs2285053、rs11225395及rs225207这3个SNP的基因型频率在观察组和对照组人群中符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，其中rs2285053位点χ2=0.05，P=0.95；rs11225395位点χ2=012，P=0.88；rs225207位点χ2=0.09，P=0.90。本文中rs243865位点基因型全部为CC，rs11568818位点基因型全部为AA，可能该位点在河南汉族人群中无多态性，因此不予分析。

2.2 MMPs基因启动子区5个SNPs与CHF的相关性分析

2.2.15个SNPs分型及PCR-RFLP结果 本研究根据电泳图谱出现条带判定基因型。本次研究中rs243865、rs11568818未表现出多态性。而rs2285053、rs11225395、rs225207这3个SNPs位点等位基因电泳图谱如图1-3。5个SNPs位点引入的酶切位点及内切酶。见表2。

表2 MMPS上5个SNPs位点等位基因及内切酶

注：1 PCR产物；2 TT；3 CT；4 CC；5 空白对照

图1 rs2285053等位基因PAGE电泳图谱

注：1 PCR产物；2 TT；3 CC；4 CT；5 空白对照

图2 rs11225395等位基因PAGE电泳图谱

注：1 PCR产物；2 AA；3 AG；4 GG；5 空白对照

图3 rs225207等位基因PAGE电泳图谱

2.2.25个SNPs等位基因和基因型频率 MMPs基因启动子区5个SNPs的多态性与CHF的相关性如表3、4。结果显示观察组rs225207的等位基因A的频率显著降低(P<0.05)，rs2285053位点T等位基因两组比较有统计学意义(P<0.05)；AA基因型在两组中差异有统计学意义(P<0.05)；rs11225395位点的T等位基因的频率在观察组明显降低(P<0.05)，TT基因型频率降低(P<0.05)；rs243865及rs11568818这两个SNPs位点的在两组基因型完全一样没有多态性，在此不予分析。

2.2.3MMPs上3个SNPS位点单倍型 用SHEsis软件统计分析，推断出rs2285053、rs11225395及rs225207构建成8种单体型，通过进一步比较，结果显示，单体型CCG的频率在两组间存在显著差异(P<0.05)。见表5。

表3 MMPs基因启动区5个SNPs位点基因型在两组中的频率分布(n/%)

注：与对照组相比，*P<0.05

表4 MMPs基因启动区5个SNPs位点等位基因在两组中的频率分布(n/%)

注：与对照组相比，*P<0.05

表5 MMPs基因启动区3个SNPs位点单倍型分析(%)

注：与对照组相比，*P<0.05

3 讨论

CHF是常见的临床综合症，是目前心血管系统疾病患者生活质量低下及死亡的重要原因之一[6]。CHF病因和发病机制仍在进一步的研究当中，其中基因多态性已成为研究热点[7]。MMPs是一类ECM降解所必需的蛋白水解酶，可以参与到多种疾病的形成当中，尤其是心血管疾病。随着临床和实验室研究的不断深入，已发现MMPs与多种心血管疾病的发生、发展有密切关联，并且其受基因调控[8]。

MMP-2几乎存在于所有心肌细胞，研究表明MMP-2可降解肌钙蛋白，损伤心肌收缩力。CHF患者MMP-2水平的改变与死亡率有着直接关系[9]，故针对如何改变MMP-2活性从而影响CHF发病率的研究也越来越多。本文结果显示，在河南新乡地区汉族群体中观察组rs2285053位点T等位基因的频率与对照组相比降低。分析其原因可能是rs2285053位点C/T等位基因的改变，可以使基因启动子区的Sp1位点的特异性序列变化，进而影响MMP-2基因转录水平[10]，减少损害心肌肌原纤维的作用，降低个体CHF危险患病风险。

研究证实MMP-8的ApoE基因敲除后会减少小鼠动脉粥样硬化的程度，降低血清血管紧张素II水平，并在病变血管处细胞黏附分子-1表达减少[11]。本文得出观察组rs11225395位点的T等位基因的频率与对照组相比降低(P<0.05)，OR=1.966,提示T等位基因降低个体CHF危险。基因功能学提示rs11225395基因位于MMP-8基因第2外显子，C-T的替换可引起MMP-8的前肽结构中第87位氨基酸谷氨酸转变为赖氨酸，从而使得MMP-8的转录活性增高2～3倍，使得细胞外基质分解明显增加[12]，从而降低了心力衰竭的易感性。

研究表明，MMP-13在某种程度上使MMP-2和MMP-9激活，进而可以破坏ECM和直接损害心肌，但也可以导致纤维连接素以及胶原蛋白降解，产生抑制心肌纤维化的作用[13]。本文结果显示，观察组rs225207的G等位基因的频率与对照组相比明显增加(P<0.05)。随着G等位基因频率的增加，间接下调了MMP-13转录水平，可能增加个体CHF危险。

多个SNP可能会降低单个位点对该疾病的影响，也可能会联合诱发疾病。我们使用SHEsis分析rs17860523、rs11225395及rs225207之间的连锁作用,及其与河南汉族群体CHF之间的相关性。得出三者一共构建成8种单体型，各个单体型在两组频率均>0.01，结果显示单体型CCG的频率在两组中比较差异有统计意义(P<0.05)，OR=2.854(95%CI=1.690～4.820)，相比单个SNP的研究更加有意义。说明单体型CCG可能是CHF个体的预后不良因素之一，而其他观察到的单体型可能与CHF个体预后没有相关性(P>0.05)。

综上所述，本文提示在河南新乡地区汉族群体中rs225207位点的G等位基因及rs2285053、rs11225395及rs225207组成的单体型CCG可能会增加CHF的患病风险；rs11225395、rs2285053位点的T等位基因可能会降低CHF的患病风险；而rs243865、rs11568818这两个位点在河南新乡地区汉族群体中无多态性。

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