多药耐药基因相关产物P-gp和Topo-Ⅱ在结直肠癌中的表达及临床意义*

廉 蕊 刘少卿 郑纪宁 代俊利*

结直肠癌(colorectal carcinoma，CRC)是消化道疾病中常见恶性肿瘤之一，是由遗传因素和环境因素的共同作用引起的，居常见恶性肿瘤的第4位，对人类的健康构成了严重的威胁。为提高患者的生存率，患者术后辅助化疗是必要的辅助治疗措施[1-2]。但是化疗药物治疗时的多药耐药性(multidrug resistance，MDR)是临床化疗常见的现象[3-5]。MDR是化疗失败的原因之一，MDR蛋白家族在化疗失败的所有机制中扮演着重要的角色[6]。本研究通过免疫组织化学检测多药耐药基因相关产物P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、拓朴异构酶Ⅱ(topoisomerase Ⅱ，Topo-Ⅱ)在CRC组织中的表达情况，分析多药耐药基因相关产物在CRC发生发展中的表达情况，研究P-gp和Topo-Ⅱ与肿瘤生物学行为的关系以及P-gp和Topo-Ⅱ两者表达的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2014年2月至2016年2月经承德医学院附属医院病理科确诊为CRC的100例患者结直肠黏膜组织标本，其中高分化和中分化标本64例，低分化和未分化标本36例；另收集40例正常结直肠黏膜组织标本。所有CRC患者在术前均未行放射治疗或者化疗，患者的相关临床及病理资料完整。

1.2 材料与试剂

兔抗人P-gp多克隆抗体(一抗，工作浓度1∶100)及兔抗人Topo-Ⅱ多克隆抗体(一抗，工作浓度1∶120)、免疫组织化学试剂盒(内含DAB显色剂)皆购自北京中杉金桥生物技术公司。

表2 在100例CRC组织中P-gp和Topo-Ⅱ的表达及生物学行为的相关因素

1.3 免疫组织化学法

采用免疫组化链霉亲和素-过氧化物酶(streptavidin peroxidase，SP)法[7]均按照免疫组织化学试剂盒说明操作，然后加一抗后4 ℃过夜，用已知的阳性CRC切片组织为阳性对照，将用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)代替一抗作为阴性对照。

1.4 实验结果判定

P-gp和Topo-Ⅱ皆主要定位于细胞浆或细胞膜上，以细胞浆内或细胞膜着黄色或棕黄色颗粒或团块作为阳性染色的标准。评分采用综合阳性细胞百分比率及染色强度评判。①染色强度：不着色记0分，浅棕黄色记1分，棕黄色记2分，深棕黄色或黄褐色记3分；②阳性细胞百分比率：＜10%记0分，10%～40%记1分，41%～70%记2分，＞70%记3分，最后将二者记分相乘为最后得分：0分为阴性(-)，1～2分为弱阳性(+)，3～5分为中阳性(++)，6～9分为强阳性(+++)，结果由两位资深病理医师双盲读片判定。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件分析所得数据，计数资料的比较采用x2检验，P-gp和Topo-Ⅱ的相关性检验采用Spearman等级相关检验分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 P-gp和Topo-Ⅱ蛋白在CRC及正常结直肠黏膜组织中的表达

(1)P-gp和Topo-Ⅱ蛋白在CRC及正常结直肠黏膜组织中的表达主要定位于细胞浆或细胞膜上，如图1所示。

(2)P-gp和Topo-IIⅡ蛋白在CRC中的阳性表达率分别为68.00%和74.00%，均明显高于结直肠正常黏膜组织，其差异有统计学意义(x2=32.208，x2=25.901；P＜0.05)，见表1。

图1 P-gp和Topo-Ⅱ蛋白在CRC中细胞浆或细胞膜上表达示图(×200)

表1 P-gp和Topo Ⅱ在CRC和正常结直肠组织中的表达(%)

2.2 P-gp和Topo-Ⅱ蛋白的表达与CRC生物学行为的关系

CRC中P-gp和Topo-Ⅱ蛋白的表达与年龄、性别无关，其差异无统计学意义(x2=0.031，x2=0.018；P＞0.05)，与分化程度、Duke's分期、浸润深度和有无淋巴结转移有相关性，其差异有统计学意义(x2=7.981，x2=4.973，x2=17.961，x2=3.957；P＜0.05)，见表2。

2.3 P-gp和Topo-Ⅱ在CRC中表达的相关性分析

采用Spearman等级相关检验分析显示，P-gp和Topo-Ⅱ在CRC中的表达呈正相关关系，差异有统计学意义(r=0.265，r=0.219；P＜0.05)。

3 讨论

3.1 CRC与化疗

CRC做为一个困难的问题，目前全球尚无解决方案。化疗是CRC患者术后可用的方法之一。为了改善生存，辅助化疗对患者一直被视为必要的消除微小转移灶以及残余的恶性肿瘤细胞，但是CRC因为MDR的存在，功效不佳，在所有耐药机制中MDR蛋白家族扮演着重要的角色在所有耐药机制中。MDR相关的蛋白质成为世界性难题，P-gp和Topo-Ⅱ是MRD家族中重要的两种蛋白质，通过减少细胞内P-gp和Topo-Ⅱ的浓度可以降低细胞的耐药性[8-13]。

3.2 P-gp和Topo-Ⅱ的表达

P-gp的最重要的作用是相当于一个外排泵的作用，属于一种跨膜糖蛋白，可将细胞内的物质通过能量的给予排出细胞外。P-gp由1280个氨基酸组成，P-gp与进入细胞内的化疗药物结合，其过程为耗能过程，可将进入肿瘤细胞内的化疗药物泵至胞外[14]。P-gp的过度表达，使得肿瘤细胞内发挥作用的化疗药物的浓度下降，最后使得肿瘤细胞产生耐药。在对与丝裂霉素(抗Topo-Ⅱ)有关的两个细胞株(敏感株和耐药株)的研究实验中，观察到耐药株的Topo-Ⅱ表达下降，证明Topo-Ⅱ的表达很大可能与细胞的敏感性呈正相关性。本研究结果表明，P-gp和Topo-Ⅱ高于正常组织，结果有统计学意义，提示P-gp和Topo-Ⅱ在耐药中发挥着重要作用。P-gp和Topo-Ⅱ与Duke's分期、浸润深度、分化程度和淋巴结转移有关，但与年龄和性别无关。在CRC中P-gp和Topo-Ⅱ与患者的性别及年龄差异，暂时且不认为二者在年龄与性别上存在差异。同时，表明在不同的Duke's分期、浸润深度、分化程度和淋巴结转移的状况下P-gp和Topo-Ⅱ可表现为不同的表达状态，对于临床合理的为患者选择适合的个体化的化疗方案具有指导意义，可为化疗方案的选择提供理论依据。本研究结果表明，恶性程度越高，P-gp和Topo-Ⅱ的蛋白表达越高，且二者之间有相关性，但二者之间的相关关系有待进一步的深入研究，有望成为临床化疗药物选择的靶向切入点，为临床CRC患者的治疗带来福音。

目前，临床对CRC的治疗，MDR是其面临最严峻的问题。研究其耐药产生的机制对于临床治疗有指导意义，对P-gp和Topo-Ⅱ等的深入研究，将有助于对CRC对化疗药物的耐药的产生机制有更深入的研究，指导临床医务工作者为患者选择最合适的个体化疗方案。但由于其产生耐药机制的不同，针对其选择的逆转耐药的方式也不同。因此，探讨P-gp和Topo-Ⅱ的表达及其之间的关系，为判断患者的耐药情况，提高患者的治疗疗效，延长患者的生存期以及指导临床治疗都能开阔更好的前景。

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