根皮苷生物转化制备根皮素工艺优化研究

汪瑾雨，余海立，刘兰庆，苏香萍，汪鋆植，2*

（1.三峡大学 生物与制药学院 湖北省生物酵素工程技术研究中心，湖北 宜昌443002；2.湖北省土家族医药研究所，湖北 宜昌 443002）

根皮素是根皮苷的脱糖基产物，存在于蔬菜，苹果、梨等水果中，是著名的天然二氢查尔酮之一[1-3]，具有抗氧化[4]、抑制酪氨酸酶活性[5-6]、抗癌[7-8]、抗炎[9]、抗菌[10]和雌激素作用[11]等多种生物活性[12]。近年来，根皮素作为抗氧化功效因子在食品领域应用广泛，李姝静等[13]制备出根皮素与β-环糊精的包合物，提高了根皮素的水溶性和抗氧化能力，有利于其加工成水基化保健食品剂型。孙玥等[14]采用等效面分析法考察了多组分食品添加剂—阿魏酸、根皮素和水溶性维生素E（vitamin E，VE）抗氧化的协同作用，并进行配方比例的响应面优化；此外，还制备出阿魏酸、根皮素及水溶性维生素E（VE）的复方微乳[15]，提高了复方抗氧化体系的稳定性和抗氧化效力，扩大了其在食品、化妆品等领域的应用。ZHANG T J等[16]用不同溶剂提取苹果渣并测定其活性，证实了根皮素可作为合成抗氧化、抗菌食品添加剂的天然替代品。然而，根皮素在植物中的含量较低[17]，而根皮苷易于从苹果、海棠等植物中大量获取，因此，利用根皮苷制备根皮素是一条可行途径[18-20]。为了更高效、环保地生产根皮素，本研究利用酵母菌生物转化根皮苷制备根皮素，并通过响应面法优化出根皮苷最佳转化工艺，以期为根皮素工业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母股份有限公司；根皮苷标准品（纯度≥98%）、根皮素标准品（纯度≥98%）：上海纯优生物科技有限公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯）：美国Tedia有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

发酵培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

HH-6数显恒温水浴锅：金坛市城西春兰实验仪器厂；ME215S型十万分之一电子天平：德国Sartorios公司；Dionex U 3000型高效液相色谱仪（high performance liquid chromatograph，HPLC）：美国戴安液相色谱有限公司；JY99-IIDN型超声波破碎仪：宁波新芝生物科技有限公司；HEV-50型自动灭菌锅：日本HIRAYAMA公司；SB-100旋转蒸发仪：日本EYELA公司；0.45 μm尼龙膜针筒过滤器：天津津腾实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母转化液收集

取斜面菌种接种至200 mL发酵培养基中，于30℃、100 r/min条件下，培养24 h，制得种子液。以5%的接种量吸取种子液至200 mL发酵培养基中，于30℃、100 r/min条件下，培养48 h后，于2 000 r/min离心10 min，弃去上清液，收集沉淀细胞。沉淀细胞用同等体积的pH 6.0的磷酸盐缓冲液淋洗两遍，置于三角烧瓶中，在冰浴条件下破碎（破碎3 s，间歇3 s，共70次，10 min），即得酵母转化液。

1.3.2 根皮苷的生物转化方法

实验组：取上述一定体积的转化液，pH自然，加入合适比例的一定浓度的根皮苷溶液，于适宜温度下水浴相应时间，沸水加热5 min，以终止反应。转化液用同等体积的乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯，于45℃减压蒸干，用甲醇溶解，并定容至一定体积，0.45 μm的微孔滤膜过滤。采用HPLC分析滤液中的根皮素，并根据根皮素标准曲线回归方程计算含量。实验中，同时设立对照组，即只加转化液，不加底物。根皮素产率按如下公式计算：

式中：C1为转化液中根皮素的质量浓度，g/L；C2为底物根皮苷的质量浓度，g/L；M1为根皮素的相对分子质量，274.27；M2为根皮苷的相对分子质量，436.41。

1.3.3 高效液相色谱分析

色谱条件：CosmailC18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈-水（55∶45，V/V）；检测波长为285 nm，流速为1.0 mL/min，柱温：30 ℃，进样量：10 μL。

1.3.4 根皮素标准曲线的绘制

精密称取0.01g的根皮素标准品，置于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度线，摇匀，即得质量浓度为1.0 g/L的根皮素标准品溶液。精密吸取标准溶液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL，分别置于10 mL容量瓶，用甲醇定容，配成质量浓度为10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL的系列根皮素标准溶液。吸取10 μL，于上述色谱条件下进样分析，每个质量浓度进样3次，计算平均峰面积。以根皮素质量浓度（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，进行线性回归，得根皮素标准回归方程为：Y=0.459 2X-1.325（R2=0.999 5）。根据根皮素标准回归方程计算样品中根皮素含量。

1.3.5 单因素试验

选取转化时间（4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h）、转化温度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）、酵母转化液与底物根皮苷体积比（液料比）（5∶1、7∶1、9∶1、11∶1、13∶1（V/V））和底物根皮苷质量浓度（8g/L、10g/L、12g/L、14g/L、16 g/L）对根皮素产率的影响，以确定响应面试验的考察因素及各因素的水平。

1.3.6 响应面试验[21-22]

根据单因素试验结果，选择转化时间（X1）、转化温度（X2）、液料比（X3）为考察因素，以根皮素产率（Y）为评价指标，按照Box-BehnkenDesign（BBD）试验设计，进行3因素3水平响应面分析试验，数据分析采用Design-Expert 8.0.6软件，从而得出生物转化制备根皮素的最佳条件。响应面试验因素与水平见表1。

表1 根皮素制备条件优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for phloretin preparation conditions optimization

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 转化时间对根皮素产率的影响

图1 转化时间对根皮素产率的影响Fig.1 Effect of conversion time on the yield of phloretin

转化时间对根皮素产率的影响见图1。由图1可知，随着转化时间的延长，根皮素产率也逐渐增加，当转化时间为18 h时，根皮素产率最高，为49.75%。若转化时间太短，底物根皮苷转化不完全；转化时间过长，转化液中酶失活。因此，选取转化时间16 h、18 h、20 h为响应面试验的取值范围。

2.1.2 转化温度对根皮素产率的影响

转化温度对根皮素产率的影响见图2。由图2可知，随着转化温度的升高，根皮素产率先增加后减少，当转化温度为40℃时，产率达最大，为48.67%；当转化温度在30℃～40℃时，根皮素产率随着转化温度的升高而缓慢增加；当转化温度高于40℃后，随着转化温度的升高，根皮素产率呈下降趋势。其原因可能是温度过高，转化液中酶失活且失活速率也加快所致。因此，选取转化温度30℃、40℃、50℃为响应面试验的取值范围。

图2 转化温度对根皮素产率的影响Fig.2 Effect of conversion temperature on the yield of phloretin

2.1.3 液料比对根皮素产率的影响

液料比对根皮素产率的影响见图3。由图3可知，随着液料比的增加，根皮素产率逐渐增加，液料比为11∶1（V/V）时产率最大且趋于稳定，为70.05%。说明在底物根皮苷的量一定的情况下，液料比达到11∶1（V/V）后，根皮素产率基本保持不变，此后无增加液料比的必要。因此，选取液料比9∶1、11∶1、13∶1（V/V）为响应面试验的取值范围。

图3 液料比对根皮素产率的影响Fig.3 Effect of liquid-material ratio on the yield of phloretin

2.1.4 底物质量浓度对根皮素产率的影响

底物质量浓度对根皮素产率的影响见图4。由图4可知，随着底物质量浓度的增加，根皮素产率也逐渐增加，但整体增加幅度相对较小，底物质量浓度在10 g/L时产率最大，为69.55%。这是因为转化液中酶的耐受能力与底物质量浓度有关，同时产物根皮素的积累也会对转化液中的酶产生抑制。底物质量浓度为8 g/L时的产率（66.21%）与底物质量浓度为10 g/L时的产率（69.55%）差异不大，且此后，继续增加底物质量浓度，根皮素产率变化不明显。

图4 底物质量浓度对根皮素转化率的影响Fig.4 Effect of substrate concentration on the yield of phloretin

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验结果

在单因素试验结果的基础上，以转化时间（X1）、转化温度（X2）、液料比（X3）为自变量，以根皮素产率（Y）为响应值进行响应面试验。响应面试验设计与结果见表2。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface experiments

2.2.2 模型建立及响应面分析

采用Design-Expert 8.0.6软件对表2数据进行处理，方差分析见表3。

由表3回归模型的方差分析结果可知，模型的F值为14.09（P＜0.01），说明拟合的方程极显著（模型可靠），但是失拟项的F值为93.15（P＜0.01），说明方程模拟的不好，不能很好用于根皮素产率的分析。因此对该模型进行手动优化，结果见表4。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

表4 手动优化后的回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model after manual optimization

由表4可知，手动优化后的回归模型F值为224.41，说明拟合的方程极显著（P＜0.01）；同时，失拟项的F值为6.95，失拟项不显著（P＞0.05），说明用转化时间、转化温度、液料比这3个参数拟合的根皮素产率方程是可行的；此外，该回归模型的相关系数R2为0.998 0，校正系数（与预测复相关系数（以上参数均说明该模型合理，实验误差小，可以用于根皮素产率的分析。

一次项X1对根皮素产率的影响有显著作用（P＜0.05），X2和X3对根皮素产率的影响达极显著水平（P＜0.01）；二次项、、对根皮素产率的影响有极显著作用（P＜0.01）；交互项X1X3对根皮素产率有极显著影响（P＜0.01），而X1X2、X2X3对根皮素产率的作用不显著（P＞0.05），无统计学差异。

利用Design-Expert 8.0.6软件对表2数据进行多元回归分析，得到的回归拟合方程如下：回归模型中X1、X2、X3前的拟合系数分别为0.61、1.93、1.99，可知各试验因素对根皮素产率影响的大小顺序为X3（液料比）＞X2（转化温度）＞X1（转化时间），其中液料比和转化温度是主要影响因素；回归方程的变异系数（coefficient of variation，CV）为0.88%，说明数据离散程度较小，在正常范围内；因此，可用该回归模型对根皮素产率进行预测和分析。由回归方程预测得到的根皮苷最佳生物转化工艺为：转化时间18.09 h、转化温度41.20℃、液料比11.52∶1（V/V），根皮素产率为70.97%。

2.3 响应曲面图分析与验证试验

表4数据通过Design-Expert 8.0.6软件进行回归拟合后，所得响应面图见图5。

由图5可知，当液料比一定时，根皮素产率随时间的延长而增加，在18 h时趋于稳定；而根皮素的产率随温度的升高呈先增后减的趋势，在40℃时根皮素产率最高，此后根皮素产率呈下降趋势，分析其原因可能是因为温度升高，转化液中酶失活所致。当转化温度一定时，根皮素产率随着时间和液料比的增加而增加，但时间过长可能会导致根皮素的水解，进而影响根皮素产率。当时间一定时，随着液料比增大，根皮素产率呈增加趋势；液料比达到11∶1（V/V）后，根皮素产率基本保持不变，此时，底物根皮苷最大限度地参与反应。

基于响应面法分析结果和实际工业生产，将理论最佳工艺调整为：转化时间18 h、转化温度41℃、液料比12∶1（V/V）。在此条件下平行验证3次，最终试验结果取平均值，得到根皮素产率为70.12%，与理论值70.97%基本相符，说明该回归模型可靠。

图5 转化时间、转化温度、液料比交互作用对根皮素产率影响的响应面与等高线Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between conversion time,conversion temperature and liquor-material ratio on the yield of phloretin

3 结论

本试验利用酿酒酵母可产β-葡萄糖苷酶，该酶专一性地作用于根皮苷的β-D-葡萄糖苷键，脱糖基为根皮素。在单因素试验的基础上，通过Box-Behnken中心组合试验设计，考察转化时间、转化温度、液料比这三个因素对根皮素产率的影响，建立数学模型，得出根皮苷生物转化最佳工艺条件为：转化时间18 h、转化温度41℃、液料比12∶1（V/V），底物质量浓度8 g/L。在此条件下，根皮素产率为70.12%。

本研究获得了酿酒酵母生物转化根皮苷为根皮素的工艺条件，与传统化学法和酸碱法相比，具有操作简单、条件温和、成本低等优点，为后期根皮素工业化的生成奠定了基础，但还需要进一步中试调试，以满足工业化生成的实际需求。

[1]BARRECA D,BELLOCCO E,CARISTI C,et al.Kumquat(Fortunella japonicaSwingle)juice:Flavonoid distribution and antioxidant properties[J].Food Res Int,2011,44(7):2190-2197.

[2]BARRECA D.Flavonoid and antioxidant properties of fruits belonging to theAnnonaandCitrusgenera[J].ACS Symp Ser,2013,1129:103-119.

[3]EHRENKRANZ J R L,NORMAN G L,KAHN C R,et al.Phlorizin:a review[J].Diabetes-Metab Res Rev,2005,21:31-38.

[4]REZK B M,HAENEN G R,WJ V D V,et al.The antioxidant activity of phloretin the disclosure of a new antioxidant pharmacophore in flavonoids[J].Biochem Bioph Resh Commun,2002,295(1):9-13.

[5]王建新，周 忠，王建国.根皮素抑制酪氨酸酶活性研究[J].香料香精化妆品，2002，（2）：4-5.

[6]LIN Y P,HSU F L,CHEN C S,et al.Constituents from the Formosan apple reduce tyrosinase activity in human epidermal melanocytes[J].Phytochemistry,2007,68(8):1189-1199.

[7]MA L,WANG R,NAN Y,et al.Phloretin exhibits an anticancer effect and enhances the anticancer ability of cisplatin on non-small cell lung cancer cell lines by regulating expression of apoptotic pathways and matrix metalloproteinases[J].Int J Oncol,2015,48(2):843-853.

[8]罗 辉，汪亚君，陈 杰，等.根皮素诱导肝癌BEL-7402细胞凋亡[J].南方医科大学学报，2008，28（7）：1249-1251.

[9]HUANG W C,WU S J,TU R S,et al.Phloretin inhibits interleukin-1β-induced COX-2 and ICAM-1 expression through inhibition of MAPK,Akt,and NF-κB signaling in human lung epithelial cells[J].Food Function,2015,6(6):1960-1967.

[10]张 英.根皮素抑菌活性及抑菌机理的研究[D].西安：陕西师范大学，2016.

[11]LERNER L J,TURKHEIMER A R,BORMAN A.Phloretin,a weak estrogen and estrogen antagonist[J].P Soc Exp Biol Med,1963,114(1):115-117.

[12]BEHZAD S,SUREDA A,BARRECA D,et al.Health effects of phloretin:from chemistry to medicine[J].Phytochem Rev,2017(2):1-7.

[13]李姝静，周自若，周 威，等.根皮素与两种β-环糊精衍生物的包合作用及性质[J].食品科学，2017，38（7）：11-16.

[14]孙 玥，余燕影，曹树稳.阿魏酸、根皮素和水溶性VE的抗氧化协同效应及其配方优化[J].食品科学，2012，33（3）：33-38.

[15]孙 玥，余燕影，曹树稳.阿魏酸、根皮素及Trolox复方微乳制备及性质[J].南昌大学学报（理科版），2013，37（5）：474-479.

[16]ZHANG T,WEI X,MIAO Z,et al.Screening for antioxidant and antibacterial activities of phenolics from Golden Delicious apple pomace[J].Chem Central J,2016,10(1):47-55.

[17]赵艳敏，王 皎，宋光明，等.苹果树枝和叶中根皮苷及根皮素含量变化研究[J].食品研究与开发，2013，34（7）：95-98.

[18]赵斐文.苹果枝叶中根皮苷的提取[J].科技创新导报，2009（29）：92-94.

[19]夏冬梅，李 敏，王道清，等.藏药俄色叶中根皮苷、根皮素含量分析[J].中国现代中药，2014，16（8）：618-622.

[20]冯雪娇，曹学丽，李 艳，等.根皮苷的应用及分离纯化研究进展[J].食品科学技术学报，2008，26（4）：13-16.

[21]李 莉，张 赛，何 强，等.响应面法在试验设计与优化中的应用[J].实验室研究与探索，2015，34（8）：41-45.

[22]张泽志，韩春亮，李成未.响应面法在试验设计与优化中的应用[J].河南教育学院学报：自然科学版，2011，20（4）：34-37.