大鼠在体缺血后处理对肺细胞凋亡及肺Bax和Bcl-2表达的影响

陈莹

（贵阳市第一人民医院病理科 贵州 贵阳 550001）

缺血后处理是指组织或器官发生缺血后，在长时间再灌注之前进行数次短暂缺血/再灌注循环，从而减轻再灌注损伤的一种保护作用。肺缺血后处理的研究起步较晚，其保护机制还未确定。因此本实验通过建立肺缺血/再灌注损伤模型，探讨缺血后处理在肺I/R损伤中的保护作用及其可能机制。

1.材料和方法

1.1 实验分组

成年SD大鼠60只，雌雄不拘，并随机分为3组，每组20只。10%水合氯醛腹腔麻醉，气管插管，接动物呼吸机。（1）sham组：开胸后游离左侧肺门，不予其它处理；（2）I/R组：开胸后于肺充盈末用无创微血管夹夹闭左侧肺门，45min后松开微血管夹，灌注180min；（3）IPO组：处理同I/R组，但在松开微血管夹即刻，采取复灌30s、停灌30s，连续6个循环，作为缺血后处理，之后再灌注180min。

1.2 标本的采集与处理

再灌注结束后，立即取出左肺，切取中段肺组织，置于福尔马林中固定，以供HE染色、免疫组化及细胞凋亡检测。

1.3 观察指标

1.3.1 病理学观察

常规石蜡包埋、切片，HE染色。

1.3.2 肺湿/干重之比

取出称重的冻存肺组织，放置电热恒温鼓风干燥箱中，温度80℃，连续烘烤24h至恒重后取出，用电子天平称重，肺组织湿重／干重比值=（湿重-干重）／干重。

1.3.3 肺组织Bax、Bcl-2表达

采用链酶亲和素一生物素一过氧化物酶（SABC）法，严格按试剂盒说明书操作结果判定：胞浆呈棕黄色颗粒状的为阳性细胞。在400倍显微镜下随机取5个视野，计数阳性细胞数及细胞总数，计算阳性细胞率。

1.3.4 细胞凋亡的检测

严格按照试剂盒说明书进行。在400×显微镜下随机取5个视野，计数阳性细胞数及细胞总数，计算凋亡指数。

1.4 统计学处理方法

所有数据用±表示，用SPSS统计学软件作统计学分析，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为显著性差异。

2.结果

2.1 病理学观察

光镜下可见sham组肺泡结构清晰，无水肿、出血。与I/R组相比IPO组的细胞损伤程度较I/R组明显减轻。

2.2 肺组织湿重／干重比值

肺湿重／干重比值是反映肺组织水肿程度，特别是肺泡内水肿的常用指标。表l结果提示IPO能够减轻肺I/R损伤所引起的肺水肿。

表1 各组肺组织湿重／干重比值的变化（±s）

表1 各组肺组织湿重／干重比值的变化（±s）

与Sham组比▲P＜0.05；与I/R组比△P＜0.05

组别 例数（n） 肺湿/干重比sham组 20 3.98±0.01△I/R组 20 8.33±0.64▲IPO组 20 4.32±0.46▲△

2.3 细胞凋亡指数

如表2所示与I/R组相比，IPO组肺组织细胞凋亡指数明显减少。该项结果表明：I/R损伤可促进细胞凋亡的发生，而IPO则可显著降低该项指标的阳性细胞数。

2.4 肺组织中Bcl-2和Bax表达的阳性细胞率：

从表2中可知，与I/R组比较，IPO组的Bcl-2表达显著升高而Bax表达明显降低。

表2 各组肺细胞凋亡指数以及Bax与Bcl-2阳性细胞率的比较

3.讨论

IPO是指组织在长时间缺血后再灌注前反复短暂再缺血处理所诱发的一种内源性保护机制。由于IPO操作简单，时机易于掌握，目前已得到临床上的高度关注。肺缺血后处理的研究相对较少，其是否可减轻肺I/R损伤还未确定。因此本实验通过复制IPO模型，即在长时间再灌注以前，采取复灌30s、停灌30s，连续6个循环的处理作为IPO组。结果与I/R组相比，IPO组的病理学改变减轻，肺湿/干重比显著降低。这些结果提示：IPO同样可减轻肺I/R损伤。

早期研究多认为肺功能障碍主要与肺组织细胞坏死有关，而近年来的实验研究[1]却表明，继发于I/R的凋亡细胞数量与细胞氧化损伤呈显著相关。缺血/再灌注后出现的氧化损伤、钙超载及能量代谢障碍等均会导致细胞凋亡增加。缺血后处理则可通过激发机体自身防护系统而抑制细胞凋亡的发生，如降低线粒体膜通透性、阻止促凋亡蛋白从线粒体向外释放和抑制Caspases的激活[2]。在本研究中我们发现，I/R组肺组织的细胞凋亡指数显著高于Sham组，而IPO组的细胞凋亡指数则较I/R组显著减低。该结果提示IPO具有明显的抗凋亡作用。

细胞凋亡的发生与Bcl-2和Bax表达密切相关。Bcl-2和Bax都是Bcl-2家族的成员，Bcl-2蛋白家族表达的异常直接调控着凋亡的发生。Bcl-2抑制细胞凋亡的作用与抗氧化、抑制Ca2+内流等因素有关，其通过抑制细胞信号传递而发挥抑制细胞凋亡、延长细胞寿命的作用。最近有文献提出Bcl-2还能抑制趋化因子巨噬细胞炎性蛋白（macrophage inflammatory protein-2，MIP-2）的升高，从而参与I/R后炎症反应的抑制作用。而Bax基因则可通过对抗Bcl-2蛋白抑制凋亡的作用发挥效应。细胞对死亡信号的敏感性取决于胞内Bcl-2/Bax竞争性的二聚体化过程。Bax同二聚体形成便可诱导凋亡；随Bcl-2蛋白表达量的上升，越来越多的Bax同二聚体分开，与Bcl-2形成比Bax/Bax更稳定的Bcl-2/Bax二聚体，拮抗了Bax/Bax诱导凋亡的作用，则细胞不发生凋亡[2]。从本实验中我们可以看出：IPO能明显增加Bcl-2的表达和抑制Bax的表达，使Bcl-2/Bax的比值升高，从而使细胞凋亡指数减少。

综上所述，本研究显示缺血后处理能较好保护I/R损伤后的肺组织结构，减轻肺水肿，并且具有显著的抗凋亡作用。其抗凋亡的机制应该与上调Bcl-2表达与抑制Bax表达，使Bcl-2/Bax的比值升高有关。

[1]Zhang J，Wu Y，Weng Z，et al.Glycyrrhizin protects brain against ischemia-reperfusion injury in mice through HMGB1-TLR4-IL-17A signalingpathway[J].Brain Res，2014，1582：176-186.

[2]Zhang J,Wu Y,Weng Z,et al.Glycyrrhizin protects brain against ischemia-reperfusion injury in mice through HMGB1-TLR4-IL-17A signaling pathway[J].Brain Res,2014,1582:176-186.

[3]董福强,田轶魁,魏民新,张鑫.缺血后处理对大鼠心肌细胞凋亡及Bcl-xl/s的影响[J].天津医药,2011(12).

[4]徐晓娜,方莲花,杜冠华.心肌缺血再灌注损伤过程中Bcl-2调控自噬的研究进展[J].中国药学杂志,2014(05).

[5]黄婷,李绍旦,杨明会,刘毅.大鼠心肌缺血再灌注实验技巧的经验总结[J].中国比较医学杂志,2017(09).