从进境杨木中首次截获条纹根瘤象(鞘翅目：象甲科)

陈 伟， 胡 萌， 伦才智， 徐 豪， 杨 娟

临沂出入境检验检疫局，山东 临沂 276034

条纹根瘤象SitonalineatusL.，又称豌豆叶象甲，属鞘翅目Coleoptera象甲科Curculionidae根瘤象属Sitona。该虫主要分布于欧洲和北美洲(Olfertetal.,2012； Vankoskyetal.,2009)，在我国新疆的阿勒泰和伊犁(刘芳政等，2000)及甘肃的陇东黄土高原(王佛生等，2011)和景泰(周军和贺春贵，2005)有分布记录。寄主主要为豆科植物，包括紫花苜蓿、白花苜蓿、野豌豆、田豌豆、宽豌豆、驴豆、蚕豆、扁豆、羽扇豆等(Petruha，1965)，其中对苜蓿的危害十分显著。该虫成虫可咬食苜蓿幼苗的叶子和生长点，使植株受到破坏甚至死亡；幼虫可蛀食根和根瘤，减少氮在根和土壤中的含量，降低土壤肥力(Cárcamoetal.,2015; Corre-Hellou & Crozat,2005)，同时，根和根瘤被害容易使病原微生物入侵，进一步引起根部腐烂。该虫一年发生1代，常以成虫形态在多年生豆科植物下或土表枯枝落叶下越冬(王登元和于江南，2010)。

2016年9月，临沂出入境检验检疫局对来自德国的带皮杨木原木进行检疫时，截获象甲科昆虫。借助显微镜观察其形态特征，并使用分子生物学方法对其进行鉴定，以明确该虫种类，为其防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源及形态学鉴定

象甲样品从德国进境带皮杨木原木中截获，经临沂出入境检验检疫局植物检疫实验室人员进行形态学鉴定并由中国检验检疫科学研究院昆虫鉴定专家进行复核后，使用蔡司Discovery V20体式显微镜对其拍照，并放入-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2 DNA提取

取样品一侧后腿，用ddH2O冲洗干净后放入1.5 mL离心管中，取200 μL chelex100上清液(用前摇匀)加至离心管中，56 ℃水浴4 h后，取出震荡1 min，置于100 ℃水浴8 min，取出震荡1 min，13000 r·min-1离心3 min(欧阳刚等，2009)，并置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.3 PCR扩增和电泳

PCR扩增mtDNA COⅠ部分序列，扩增引物为通用引物LCO1490(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和HCO2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)(Folmeretal.，1994)，由北京擎科新业生物技术有限公司合成。反应体系：擎科金牌Mix 22 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL。扩增反应条件：预变性94 ℃ 2 min，变性94 ℃ 1 min，退火53 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 1 min，运行35个循环后，72 ℃再延伸10 min；4 ℃保温。取6 μL PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检验，记录结果。PCR产物测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.4 序列比对及系统进化树构建

对于测序结果，首先根据测序峰值进行人工校对，切除两端不可信区域，5′端和3′端各切除40和60 bp后，将测序结果提交至NCBI进行比对。选取菜豆象Acanthoscelidesobtectus(NC035677)为外群，用MEGA5.05软件将测序结果及GenBank中获得的序列进行分析，并辅以人工校对，计算序列间遗传距离；采用Kimura 2-paramter距离矩阵，以邻接法构建系统树，系统树各分支的置信度(Bootstrap)均进行1000次的重复检验。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

显微观察可以看出，截获昆虫成虫体长3.2～5.3 mm，宽1.0～1.5 mm，黑色或棕色。身体覆盖灰色鳞片和短刚毛，前胸背板前缘两侧无长纤毛(图1A)；喙较粗壮，方形，短于前胸背板，端部向两侧扩展；眼大，微凸，侧生；额宽于喙，额与喙不分离，较平坦，有细而深的中沟；上颚没有颚疤；触角红色，膝状，触角窝侧背缘缘基尖隆，触角沟强烈弯向腹面，当触角收回靠近头部时，触角的柄节常指向眼下方；前胸最宽处位于身体中部；鞘翅上有交替排列的长刚毛连接成的条状纹路，头和前胸背部也有分布且与鞘翅相连接；前足基节相连或接近，有窄槽位于前胸背板腹面；股节黑色，胫节和跗节红色；爪离生，爪具附爪，第三跗节呈明显二叶状(图1B)。

根据文献记载(Bright，1994； Bright & Bouchard，2008)，截获昆虫的形态特征与条纹根瘤象相似。

图1 2016年9月在进口杨木中截获的条纹根瘤象形态图Fig.1 A close-up photograph of the morphological characteristics of S. lineatus intercepted at imported poplar logs on September 2016A：背面观；B：腹面观。A: Dorsal view； B:Ventral view.

2.2 基于mtCOⅠ的遗传距离与系统发育分析

样品经PCR扩增、测序，得到1条大小为698 bp的序列。Blast比对结果表明，与目的片段相似度最高的7个物种分别为条纹根瘤象Sitonalineatus、细纹根瘤象S.lineellus、S.suturalis、斑翅根瘤象S.macularius、驴豆根瘤象S.callosus、S.languidus、S.lepidus，其中与GenBank中登录号KM444588的条纹根瘤象mtCOⅠ序列相似性达100%(表1)。此外，本实验样品与条纹根瘤象的遗传距离均<1%。从系统进化树(图2)也可以看出，本实验昆虫样品与条纹根瘤象(KM444588)的序列明显聚为一支，置信度高达99%，且与外群差异明显。

表1 GenBank中7种高相似度种类与样品信息表Table 1 Information of 7 high similarity species and samples in GenBank

图2 基于COⅠ序列构建的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on COⅠ sequence

结合形态学特征和分子水平的分析结果，可将截获的象甲科昆虫鉴定为条纹根瘤象。

3 讨论

随着经济全球化进程的加快，我国进境原木及木质包装的数量激增。近几年，从原木及木质包装中检出的有害生物种类越来越多，象甲科昆虫就是其中重要的一类。目前，对进境象甲科昆虫的鉴定主要以形态特征观察为主；但由于象甲科昆虫种类繁多，且国外种的鉴定资料相对缺乏，加之口岸检疫中常截获到昆虫早期虫态(卵、幼虫和蛹)或不完整虫体，其形态鉴定工作仍存在较大困难。随着分子生物学技术的发展，利用特征片段基因对物种进行鉴定已获得快速发展，尤其以昆虫mtCOⅠ为分子标记的方法得到广泛应用(段晓东等，2011)。使用分子手段进行物种鉴定具有快速、高效，不受物种形态、发育期等限制的优点；但单纯使用分子手段进行分类鉴定存在样品久置易降解而导致扩增失败以及分子数据库不完善等问题。研究表明，利用col1基因作条形码进行昆虫物种鉴定的准确率通常可达到90%以上，对某些种类甚至可达到100%，但对于一些近似种的鉴定仍存在一定的风险(Guoetal.,2014)。因此，利用标准条形码进行物种鉴定时应考虑其存在的风险性，可选用2种或2种以上的基因片段结合验证，或与形态学方法相结合，以提高鉴定的准确性。本研究采用形态学与分子生物学相结合的方法将截获的象甲科昆虫鉴定为条纹根瘤象，弥补了条纹根瘤象传统形态鉴定的不足，为其他象甲科昆虫的鉴定提供了参考，对象甲科昆虫的检疫鉴定工作具有重要意义，对口岸检验检疫部门进行快速准确的物种鉴定具有很大的帮助。

2014年，天津出入境检验检疫局曾从美国进口的天然圣诞树上截获豌豆叶象甲。此次为我国首次从进境带皮杨木中截获该有害生物。条纹根瘤象可以随树木或带皮原木传入我国，其传播途径需要引起检验检疫部门的关注。

条纹根瘤象虽未被列入我国检疫性名录，但其对畜牧业发展具有很大的潜在危害性。如该虫在加拿大的草原和牧场发生了严重危害，且危害呈现持续扩张的态势(Olfertetal.,2012)。对于条纹根瘤象的防治，一方面需要投入大量的杀虫剂以减少其成虫和幼虫对苜蓿植株的危害，另一方面需加大氮肥的投入量以补偿其幼虫危害根瘤所造成的土壤肥力的降低。在一些受害严重的苜蓿草场，很多种植者因这2项费用的投入成本过高而不得不放弃原有的苜蓿种植业。我国现有的苜蓿草场的分布地气候条件与欧洲和北美洲类似(刘艳俊等，2017)，条纹根瘤象一旦传入很容易定殖和扩散。因此，对其加强检疫对保护我国苜蓿产业的健康发展具有非常重要的意义。

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