腋淋巴结阳性乳腺浸润性导管癌差异蛋白的质谱分析

傅金瑞 王高升 王学超 张超 张晨磊 王广舜 刘金波

乳腺癌是指发生于乳腺导管上皮细胞的恶性肿瘤，是女性常见的肿瘤之一［1］，而浸润性导管癌是乳腺癌中最为多见的病理类型。研究发现，是否有腋淋巴结转移是制定浸润性导管癌治疗方案的重要参考依据［2］。本研究采用双向凝胶电泳（two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2D-PAGE）结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MELDI-TOF-MS）等蛋白质组学技术，对淋巴结转移和未转移两组浸润性导管癌患者的血清蛋白表达谱进行分析，寻找与浸润性导管癌腋淋巴结转移密切相关的血清蛋白标志物，有助于深入解析其病理过程，以及临床对浸润性导管癌是否发生腋淋巴结转移作出及时准确的鉴定。

孟子云：“天将降大任于斯人也，必先苦其心志，劳其筋骨，饿其体肤，空乏其身，行拂乱其所为。”苦而不言，是让我们静静地蜕变，待到时运际遇，一鸣而天下惊。

美国国家标准学会专利许可政策演进考察............................................................................................杨正宇 03.88

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2015年3月—2016年5月本院收治的乳腺浸润性导管癌患者血清样本24份，其中确诊发生及未发生腋淋巴结转移的样本各12份。患者均为女性；年龄44～65岁，平均（54.5±10.5）岁；均未接受手术、放疗或化疗；具有可比性。患者于清晨空腹抽血，静置20 min，以3 500 r/min离心15 min。用EP管分装500 μL血清，编号后于-80 ℃冰箱保存备用。检测时等量混合每组样本。

1.2 试剂和仪器 尿素、CHAPS（美国Bio-Rad公司）；蛋白定量染液（美国Thermo Scientific公司）；乙腈CAN（美国Merck公司）；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA，美国DIMA公司）；胰蛋白酶（Trypsin Gold，美国Promega公司）；基质α-氰基-4-羟基肉桂酸、碳酸氢铵（美国Fluka公司）；硫脲、血清高丰度蛋白去除试剂盒、2-D Clean-up及2-D Quant试剂盒（美国Sigma公司）；等电聚焦仪（美国Bio-Rad公司），型号为 PROTEANIEF；Ettan DALT Six电泳系统、ImageScanner扫描仪、LabScan软件（美国Amersham公 司）；MALDI-TOF-MS仪、Flex Control软件、BioTools软件（美国Bruker公司）；Maccot蛋白数据库检索软件（英国Matrix Science公司）。

2.2 MALDI-TOF-MS质谱分析 经过对被标记差异蛋白点的切取与酶解，将处理好的肽段送入质谱仪进行质谱鉴定。将质谱分析得到的PMF数据通过MASCOT蛋白质检索软件进行蛋白检索，选择Swiss-port数据库。检索参数为：肽片段分子质量容许误差100 ppm；固定修饰为脲甲基半胱氨酸，可变修饰为氧化。除去高丰度蛋白，共鉴定出5种高可信度蛋白质，分别是表达上调的T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1（T-lymphoma invasion and metastasisinducing protein 1，Tiam1）、组织蛋白酶 K（cathepsin K，CatK）、血管内皮生长因子B（vascular endothelial growth factor B，VEGF-B）、肌动蛋白相关蛋白复合物 3（actin-related protein complex subunit 3，ARPC3）以及表达下调的抑癌蛋白Necdin。图2为Tiam1肽指纹谱，表1为所筛选差异蛋白的鉴定结果。

不同规模的事务所对于从业人员的要求也不尽相同。一般情况来说，规模大的会计师事务所对从业人员的专业素质与职业经历比较看重，而中小会计师事务所在这些方面一般要求会弱化一些。特别是对于大多数的会计师事务所而言，专业性人才还比较缺乏，如信息技术人员、行业专家等，由于这类人才的缺失，大型会计师事务所的服务水平很有限，尽管所内人员履历丰富，但是年龄、创新意识及业务水平专一是其潜在问题。

1.3.1 样品蛋白的处理 采用血清高丰度蛋白去除试剂盒去除血清样品的白蛋白和免疫球蛋白，采用2-D Clean-up试剂盒去除盐、脂肪、多糖等干扰双向电泳的物质，接着用2-D Quant试剂盒进行蛋白质浓度测定（实验步骤均按照说明书操作），分装后-80 ℃冰箱冻存。

1.3.3 凝胶图谱扫描与分析 利用扫描仪将凝胶进行投射扫描后，使用Image Master 2D Platinum凝胶分析系统依次进行凝胶位点检测、背景消减匹配等分析，筛选标记蛋白点。

1.3.2 2D-PAGE 取300 μg蛋白样品与水化液混合至450 μL，上样24 cm IPG胶条进行第一向电泳，程序设定为：30 V，12 h；100 V，1 h；1 000 V， 1 h；8 000 V，5 h；2 000 V，8 h。等电聚焦结束后，将 IPG胶条置于平衡缓冲液中15 min。将平衡好的胶条转入垂直电泳槽中进行第二向电泳。后用考马斯亮蓝G-250对电泳凝胶进行染色。

1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0软件对所得数据进行t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

1.3.4 差异蛋白点肽质量指纹分析及鉴定 挖取差异蛋白质点，蛋白质胶内酶解后获得酶解肽段，打开Flex control软件，将样品板放入质谱仪，用Auto run的方法进行样品分析。肽质量指纹图谱（peptide mass fingerprinting，PMF）用Flex analysis软件标峰，Biotool软件搜库。

2 结果

2.1 2D-PAGE图谱及其分析 对两组样本总蛋白分别进行3次电泳，3次电泳结果相似，选择清晰度高且点数多的胶作为参考胶，进行两组间的匹配分析，获得人乳腺浸润性导管癌腋淋巴结转移组及无转移组血清样本的电泳图谱。用扫描仪投射扫描后，利用凝胶图像分析软件对两组样本总蛋白进行凝胶位点检测、背景消减和匹配等分析处理，筛选标记出差异2倍以上的蛋白质点11个，留做下一步的质谱鉴定，见图1。

1.3 方法

图1 乳腺浸润性导管癌患者腋淋巴结转移组（S1）与无转移组（C1）的凝胶图谱

表1 5种高可信度差异蛋白的鉴定结果

3 讨论

对于乳腺癌的蛋白质组学研究，国内外均已做了较为广泛的探讨。高永生等［6］对有淋巴结转移和无淋巴结转移的乳腺癌组织蛋白进行了2D-PAGE以及MALDI-TOF-MS技术质谱鉴定，筛选出了可能参与乳腺癌浸润与转移过程的Ezrin、Stathmin等蛋白。侯巍巍等［8］对乳腺浸润性导管癌组织及癌旁正常乳腺组织行2D-PAGE及质谱分析，筛查出了在癌组织中高表达的热休克蛋白27、70、90，认为其有可能成为乳腺浸润性导管癌的联合特异性标记物。Boccardo等［9］同样利用MALDI-TOF-MS技术筛选出了血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang- Ⅱ），其血清浓度可作为乳腺癌，尤其是术后患者病死率的强预测因子。

图2 T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1（Tiam1）的肽指纹谱

与20世纪普遍的“异病同药”理论不同，近年来肿瘤个性化治疗的理念越来越深入人心，针对不同类型肿瘤的靶向性药物日益增多，或者说大部分药物尤其是新近开发的药物被要求量型而用，极大提高了肿瘤治疗的质量［3］。对于传统的乳腺癌标志物，如人类表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）的研究已经取得了较大的成就，临床上能够用赫赛汀等靶向药物有效治疗HER2过度表达和基因扩增的乳腺癌患者［4］。再如对Ezrin蛋白的研究发现，其广泛参与了乳腺癌细胞的增殖、凋亡、黏附、侵袭转移以及新生血管发生的调节过程，并且该蛋白对某些非肿瘤疾病也具有很大的临床价值［5-6］。所以要想精准治疗，就要继续寻找各种类型的肿瘤，甚至同一种类型肿瘤中不同病理类型或分期病例所特有的靶标，即蛋白标志物。蛋白质组学技术如MALDI-TOF-MS技术，在蛋白标志物筛查中具有相对质高价廉的独特优势，此技术已广泛应用于包括肿瘤在内的多种疾病的研究过程［7］，被证实是较为前沿而实用的技术之一。本研究即采用该技术筛查腋淋巴结阳性乳腺浸润性导管癌的标志蛋白。

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浸润性导管癌约占乳腺癌的3/4，恶性程度较高，并且在发现时半数左右已有淋巴或血行转移，严重影响了患者的手术效果以及5年或10年生存率，而腋淋巴结状况是制定浸润性导管癌治疗方案的重要参考依据，是浸润性导管癌独立的预后影响因子［10-11］。因此，本研究在综合近年来国内外相关文献的基础上，利用2D-PAGE以及MALDI-TOF-MS技术，对与乳腺浸润性导管癌腋淋巴结转移密切相关的血清蛋白标志物进行了筛选鉴定。

以八个半综合征为表现的桥脑出血合并Wernicke脑病1例报告 …………… 袁伟杰，李桂心，邓德旺 408

本研究中，两组的血清经过了2D-PAGE和MALDI-TOF-MS质谱鉴定并与美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）蛋白质数据库进行了比对分析，从11个差异蛋白点中筛查出5个潜在的蛋白标志物。其中Tiam1、CatK以及Necdin蛋白已有文献报道与乳腺癌的发生发展相关；VEGF-B已有与其他肿瘤关系的报道；ARPC3尚未见与肿瘤关系的报道。

Tiam1是二磷酸鸟嘌呤核苷酸（guanosine diphosphate，GDP）与三磷酸鸟嘌呤核苷酸（guanosine triphosphate，GTP）的转换因子，即鸟苷酸转换因子（guanine nucleotide exchange factor，GEF），已证实其表达与乳腺癌的恶性程度及淋巴转移密切相关，可作为乳腺癌的独立预后因子［12］。CatK是一种半胱氨酸蛋白酶，在破骨细胞的间接骨吸收中有较强的溶解胶原的活性，在恶性黑色素瘤细胞中高表达，在皮肤和肺的成纤维细胞中也有表达，而在乳腺癌、非小细胞肺癌、胃腺癌、结直肠腺癌等肿瘤细胞中表达均为阴性［13］。但另有报道称，CatK表达于骨转移的乳腺癌细胞中，其抑制剂L-235能够显著抑制裸鼠人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的浸润和转移［14］。VEGF-B能促进血管新生，增强肿瘤细胞侵袭转移能力。作为血管重塑因子，Yang等［15］发现VEGF-B能够经由异于血管内皮生长因子A（VEGF-A）的作用机制促进黑色素瘤及肺鳞癌的转移，从而导致患者的存活率降低。Necdin蛋白是第一个被发现的黑色素瘤相关抗原（melanoma associated antigens，MAGE）超家族成员，是一个以p53为目标并调节其生物功能的生长抑制因子。Lee等［16］发现，与过表达变异型Necdin的鼠乳腺肿瘤细胞相比，过表达野生型Necdin的侵袭性和肺转移功能显著减弱。肌动相关蛋白2/3复合体（actinrelated protein 2/3，ARP2/3）是一种肌动蛋白装配蛋白，可以促进细胞板状伪足中的肌动蛋白聚集、装配，推动细胞移动。Kinoshita等［17］发现其亚单位5（ARPC5）在头颈部鳞癌组织的表达明显高于非癌组织。沉默或抑制ARPC5在人舌癌细胞系HSC3的表达，可以引起细胞微丝骨架的重组及细胞形态的圆球样改变，细胞的浸润转移功能明显受到抑制。同样，Rauhala等［18］的实验显示，沉默肌动蛋白相关蛋白复合物亚单位4（ARPC4）的表达能够显著降低胰腺癌细胞系Hs700T和HPAFII的迁移能力。但尚未见ARPC3与肿瘤细胞关系的报道。

总之，伴有腋淋巴结转移与无淋巴结转移的乳腺浸润性导管癌在血清蛋白表达上存在很多差异，提示乳腺癌的转移过程是多种蛋白共同作用的结果，寻找其中的主要蛋白，可以作为判断其转移的标志物，也有助于阐明其发生转移的病理机制。限于条件，本研究所收集的血清样本数量较少，后续工作应进一步完善实验设计。

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