滇龙胆GrDXR基因特异性片段的克隆

桂子昌　李猛　张晓东

摘 要：GrDXR基因功能分析是揭示滇龙胆中MEP途径的基础，试验提取滇龙胆总RNA，通过RT-PCR技术进行进行扩增，所获得片段连接T载体后，进行测序，并进行序列分析。结果获得了279 bp的基因片段，将测序结果与原基因序列进行比对，确认序列为GrDXR基因特异片段，为阐明其基因功能奠定基础。

关键词：滇龙胆；GrDXR基因；特异性片段；基因克隆

中图分类号： Q785 文献标识码： A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.03.002

Abstract： The functional analysis of GrDXR gene is the basis of revealing the MEP pathway in Gentiana rigescens. Total RNA was extracted from Gentiana rigescensby experiment， and the fragment was obtained by RT-PCR technology， then it was sequenced and analyzed after ligating into T vector. Results showed that 279 bp gene specific fragment was obtained， and was verified by alignment with the original gene， which would pave ways for the functional elucidation of this gene.

Key words： Gentiana rigescens；GrDXR gene； specific fragment； gene cloning

滇龍胆（Gentiana rigescens Franch.）为多年生草本植物，主要分布于云南、四川等地，其根部用来治疗肝炎和胆囊炎[1-2]。目前，由于滇龙胆市场需求量逐年增加，野生滇龙胆遭到人为大肆破坏[3]。从合成生物学角度来看，滇龙胆主要药效成分为龙胆苦苷，要大量合成龙胆苦苷，首先必须先弄清龙胆苦苷的生物合成途径及其调控机理[4]。1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶（GrDXR）能够催化1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸（DXP）生成2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP），是龙胆苦苷生物合成中MEP途径的重要限速酶[5]，对GrDXR进行基因功能分析是揭示滇龙胆中MEP途径的基础。RNAi是指利用一段特异的双链RNA或单链反义RNA通过注射、转染或转基因的方法导入到细胞或模式生物体内，启动一套信号通路来最终降解与这段RNA对应的mRNA，使该mRNA无法翻译成蛋白质，从而在mRNA层面阻断对应基因的功能[6]。研究表明RNAi技术是验证基因功能的重要手段[7]，RNAi干扰的特异性和干扰效率取决于所选序列的特异性[7]。本研究采用比对分析的方法，获得GrDXR基因序列的特异性片段，通过PCR技术对该片段进行扩增，然后进行TA克隆，最后通过测序手段确认已获得GrDXR基因的特异性片段，旨在为GrDXR基因功能的解析奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 植物材料为滇龙胆（G. rigescens Franch.ex Hemsl）无菌苗，来自玉溪师范学院分子生物学实验室。

1.1.2 生化试剂及试剂盒 氯仿、异丙醇、无水乙醇、ddH2O、Amp、TAE、2M醋酸钠、MAX DNA Polymerase、质粒抽提溶液SolutionⅠ、SolutionⅡ、SolutionⅢ、Tris-HCl、RNaseA、TE缓冲液、50%灭菌甘油、DNA Marker、LB液体培养基、琼脂等。

1.1.3 质粒和载体 克隆载体pMD19-T Vector 购自Takara公司用于TA克隆，大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞DH 5α购自全氏金公司。

1.1.4 主要仪器设备 全套移液器、离心管、电热恒温水槽、高速离心机、掌上离心机、凝胶成像系统、冷藏柜、制冰机、超纯水系统、高压灭菌锅、电热恒温干燥箱、微波炉、电泳槽、梳齿、配套的制胶槽、电子天平、金属浴、研钵、刀片、PCR仪、摇床培养箱、超净台等。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取、逆转录和PCR扩增 RNA提取、逆转录过程参照张晓东等[5]文献，按照MAX DNA Polymerase使用说明，取出PCR所需试剂，置于冰上，PCR反应体系如下：cDNA 模板2 μL，MAX DNA Polymerase12.5 μL，基因特异引物F（10 μM）1 μL，基因特异引物R（10 μM）1 μL，ddH2O8.5 μL。总共25 μL。向PCR管内分别加入引物信息：

RNAiDXR-F：GGATCCACATTGCCCTGGCTAACAAGG；

RNAiDXR-R：CTCGAGAATCGACGGTAATCT-

TCTTCCC。

PCR反应条件：（98 ℃ 10 s → 59 ℃ 15 s → 72 ℃ 5 s ）× 35

PCR加尾：

Taq 1 μL

10×Buffer 3 μL

dATP 1 μL

PCR产物 25 μL 72 ℃ 30 min

1.2.2 琼脂糖凝胶电泳 （1）琼脂糖凝胶的制备。称0.3 g琼脂糖粉于锥形瓶，加入DNA电泳缓冲液1×TAE 30 mL，微波炉加热溶解。待凝胶液稍冷却至60 ℃后加入EB 2 μL，摇匀，倒胶。

（2）上样。将DNA或RNA样品与1/6总体积的6×Loding buffer混合，再加入1×TAE使体系总体积至20 μL。

（3）电泳。电压5～8 V·cm-1，根据指示剂位置判定停止电泳后，在凝胶成像系统进行结果观测。

1.2.3 目的DNA片段回收 （1）在紫外灯下将含有目的片段琼脂糖凝胶用刀片切下来，此时注意尽量切除不含目的片段的凝胶，以提高DNA回收率。将其切碎，置于带孔和石英棉的0.5 mLEP管中。

（2）将0.5 mL EP管置于1.5 mLEP中，室温12 000 rpm离心15 min。

（3）取出0.5 mL EP管，将上清转到新的EP管中。

（4）若有凝胶残留，可液氮冷冻后，室温12 000 rpm离心15 min。

（5）将收集到的溶胶液中，加入1/10体积的3M NaAc和等体积的异丙醇混合均匀，置于-20 ℃沉淀30 min。

（6）4 ℃，12 000 rpm离心20 min。

（7）弃上清，使用75%乙醇清洗2次。

（8）用枪吸去可见的残留酒精，室温自然干燥3～5 min，用适量的1×TE（pH值8.0）或ddH2O溶解，-20 ℃保存备用。

1.2.4 目的片段TA克隆 采用pMD19-T vector kit （Takara），反应体系如下：目的片段DNA（0.1～0.2 pmol）2.5 μL，T-载体（50 μg·mL-1）0.5 μL，Ligation Solution L3 μL，ddH2O2.5 μL。金属浴16℃过夜连接12 h。

1.2.5 质粒DNA热激转化 （1）将50 μL大肠杆菌感受态细胞DH5α加入质粒6 μL体系中。

（2）冰浴20 min，42 ℃热刺激45 s，冰浴2 min。

（3）加入890 μL SOC，37 ℃摇床200 rpm 45～60 min。

（4）培养结束后，10 000 rpm离心1 min。

（5）在超净台上吸去上清，剩余约0.1 mL时，用枪混匀，接入带有Amp抗性的LB平板上，用无菌三角玻璃棒涂布均匀。

（6）37 ℃过夜培养。

1.2.6 质粒抽提 （1）取2.0 mL培养物于EP管中，室温12 000 rpm离心1 min。

（2）弃上清，将EP管倒扣到卫生纸上除尽上清，加入SolutionⅠ200 μL，剧烈振荡悬浮菌体后，加入SolutionⅡ400 μL颠倒离心管5～6次。

（3）加入Solution Ⅲ 300 μL，振荡，再加入25 μL氯仿：异戊醇（24：1）混匀，室温13 000 rpm离心10 min。

（4）转移上清于一个洁净离心管中，加异丙醇550 μL（等体积）混匀，-20 ℃静置10 min，然后13 000 rpm，4 ℃离心15 min。

（5）弃上清，用75%乙醇1 mL清洗沉淀，然后12 000 rpm，4 ℃离心5 min。

（6）真空干燥沉淀2 min后，加20 μL含有RNaseA（20 μg·mL-1）的1×TE溶解。

（7）取2 μL在1%的琼脂糖凝胶上电泳检测结果，其余-20 ℃保存。

1.2.7 质粒PCR检测 以挑取菌落的菌液为模板，使用Taq酶、△DXR片段引物、dNTP、Buffer等，进行PCR检测，PCR产物使用琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.8 测序检测 对PCR检测正确的克隆，取2 μL菌液，接种于3 mL LB+Amp液体培养基中，37 ℃ 200 rpm·min-1摇菌12 h后，取1 mL寄送上海进行DNA测序。

2 结果与分析

2.1 特异片段扩增

以滇龙胆叶片cDNA为模板，使用GrDXR基因特异片段△DXR引物扩增，结果扩增到300 bp大小的片段（图1）。

2.2 连接、转化与重组质粒的筛选

目的片段胶回收后，连接至19T载体，通过热激转化，涂布到带Amp抗性的LB平板上，37 ℃过夜培养，挑白色菌落，进行摇菌。通过SDS碱裂解法提取质粒DNA后，使用PCR进行检测，检测结果如图2，表明所挑克隆全部正确。

2.3 测序结果分析

随机选择PCR检测正确的克隆E1、E6和E9，送上海生工进行测序，结果表明只有E6正确，序列如下：

ZB03190283（E6）M13+_J_B10（19T-△DXR）GGGTTCCTTCGGTCAGTTGTATTAGACTCGGTACG

CGCGGATCTTCCAGAGATTGGATCCACATTGCCCT

GGCTAACAAGGAGACACTAATTGCTGGTGGTCCTT

TTGTTCTTCCTTTGGCGCAAAAGATAATGTTAAGA

TTTTGCCTGCTGATTCAGAACATTCTGCTATATTTC

AGTGTATACAAGGTTTGCCTGAGGGTGCTCTAAGG

CGTATTATTTTAACTGCATCTGGCGGTTCTTTCAGG

GATTGGCCTGTTGAGAAATTGAAAGAAGTTAAGG

TAGCAGATGCCTTGAAGCATCCCAATTGGAACAT

GGGGAAGAAGATTACCGTCGATTCTGAGAATCGT

CGAACGGCAGGCG

其中，加粗部分分別为酶切位点BamHI和XhoI，下划线部分为GrDXR基因特异性片段△DXR。

3 讨 论

在萜类生物合成过程中，DXR能够催化DXP生产MEP，该反应能够被来自于链霉菌的膦胺霉素所抑制[8]。由于DXR是龙胆苦苷生物合成途径中的关键酶[4]，研究GrDXR基因功能，有助于龙胆苦苷生物合成途径的解析，能够为通过合成生物学途径合成目标产物奠定基础。同时，大多数细菌和顶福门寄生虫都使用唯一的MEP途径合成萜类化合物，而人类和动物使用甲羟戊酸途径合成萜类，因此，研究害虫和植物的DXR蛋白，有助于各種抗菌剂的研发。目前，DXR基因在弓形虫[9]、铁皮石斛[10]、玫瑰[11]、白木香[12]、丹参[13]、滇龙胆[5]等许多物种中已被克隆和研究，但是GrDXR基因的功能尚不清楚。探究一个基因功能，一般需要进行三方面的研究：（1）过表达，即让目的基因在生物体内大量表达，检测表型变化和生理生化变化；（2）敲除，即除去该基因，可以从DNA、RNA水平上进行移植或敲除，检测表型变化和生理生化变化，RNAi技术是在RNA水平对基因表达进行抑制；（3）互补试验，即将目的基因转入该类基因的突变体，看是否能够恢复野生型。RNAi方法属于第二方面的研究，研究表明RNAi方法的优点是试验周期较短，缺点是有时特异性不够强[6]。在RNAi技术中，所选基因序列的特异性决定其干扰特异性与干扰效率[7]。本研究通过选取GrDXR基因片段，与滇龙胆转录组数据库进行比对分析，获得该基因特异性片段序列，从而保证了基因片段的特异性，并进行克隆，为通过RNAi技术研究GrDXR基因功能奠定基础。

参考文献：

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