西南地区榧树属植物3种不同总DNA提取方法的比较分析

刘风路　张金丽　李靖　马长乐

摘 要：以西南地区榧树属植物叶片为材料，利用改良CTAB法，改良SDS法和试剂盒法提取其总DNA，采用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳方法检测所得总DNA的得率和纯度，用PCR扩增的方法检测所得总DNA的质量，并对3种不同提取方法的结果进行比较分析。结果表明，3种不同提取方法提取到的总DNA都能满足后期分子标记的要求，其中，改良CTAB法得率最高但纯度稍差，改良SDS法次之，试剂盒法得率最低但纯度高。为了更好的进行后期的分子试验，选择试剂盒法提取纯度较高的DNA。

关键词：DNA提取；榧树属；PCR扩增

中图分类号：S718.43 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.03.001

Abstract：In present study， three different methods of total DNA extraction， including SDS， CTAB and DNA extraction Kit （DNeasy Plant Mini Kit） were used to isolate genomic DNA from leaf materials of Torreya. The total genomic DNA yielded by the three methods were quantified and analyzed by spectrophotometer， agarose gel electrophoresis and PCR reaction， respectively. The results showed that the total DNA extracted by three different extraction methods could meet the requirements of the later molecular markers. And the modified CTAB method had the highest yield but the lesser purity， followed by the modified SDS method； the kit method had the lowest yield of but the high purity. In order to better carry out later molecular experiments， the kit method was selected to extract DNA with higher purity.

Key words： DNA extraction methods； Torreya； PCR amplification

榧樹属（Torreya Arn.）属于裸子植物门红豆杉科（Taxaceae），我国共有5种2变种，均被列为国家Ⅱ级重点保护野生植物[1-3]，其中，西南地区野生榧属植物有2种1变种：巴山榧（T. fargesii），四川榧[4]（T. parvifolia）和云南榧（T. yunnanensis）。榧树是集药用、果用、油用、材用、观赏和环保等多种用途于一体的珍贵经济树种[5-8]。

受抗癌药物研究热度增高的影响，近年来对榧树属植物药用功能和遗传保护方面的关注日益增多。高质量的总DNA是进行分子生物学实验的基础，也是实验是否能够成功的关键因素之一，而提取到的总DNA纯度是制约PCR反应的因素之一[9-10]，因此，能够提取到质量和纯度均较高的总DNA十分重要。胡文翠等[11]用CTAB法分别对香榧胚乳、新老叶片以及1年生幼果进行DNA提取发现，以香榧嫩叶为试验材料提取DNA的效果最好。胡芳名等[12]用改良CTAB法，提取到香榧种子胚乳中的总DNA，但此方法操作较为繁琐，获得的初级提取物杂质较多。叶冰莹等[13]用低pH值介质，高盐沉淀蛋白质方法提取阔叶榧新鲜叶片总DNA，所得总DNA质量和纯度均较高，可直接用于限制性内切酶酶切，并可用于随机引物PCR扩增。

由于裸子植物组织通常含有较高的次生代谢物质，这些次生物质与核酸形成复合物，提取出的总DNA质量和纯度通常很难达到分子生物学实验的需求[13]，而且不同植物体内化学成分存在一定差异，导致即使近缘类群提取总DNA的方法也略有不同，因此，需要针对不同样品的特点建立有效的提取方法。

本试验使用改良CTAB法、改良SDS法和试剂盒法对西南地区榧属植物的总DNA进行比较分析，以找到其最佳的提取方法，旨在为开展后续的分子生物学试验奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

供试巴山榧和四川榧嫩叶采自野外（硅胶干燥并在-20 ℃下保存），云南榧嫩叶采自学校大棚扦插栽培的植株（试验前1 h采集，置于冰盒中备用），样品编号及采集地如表1所示。

1.2 仪器与试剂

主要仪器为制冰机、冷冻高速离心机、PCR仪、电泳槽、电泳仪、冰箱、烘箱、凝胶成像仪、分光光度计等。提取液为SDS提取缓冲液[14]和CTAB-free缓冲液[15]。

1.3 方 法

1.3.1 总DNA提取方法 参照刘杰等[14] SDS法和CTAB法操作步骤并稍加改变提取总DNA，区别在于：精确称量0.03 g叶片；氯仿-异戊醇（体积比24∶1）抽提3次；试剂盒法使用新型快速植物基因组DNA提取试剂盒（BioTeke），操作步骤按试验说明书进行。

1.3.2 DNA检测方法 使用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳法检测总DNA的得率、纯度和质量，并对核糖体ITS片段和叶绿体的psbA-trnH片段进行PCR扩增，进一步检测所得总DNA的质量。

（1）总DNA得率和纯度检测。各取1 μL总DNA溶液置于Nandrop2000超微量紫外分光光度计中，可得到总DNA浓度和A260/A280值，以总DNA浓度计算其得率，根据A260/A280值判断总DNA的纯度。

（2）总DNA质量检测。在1%的琼脂糖凝胶中，于150 V电压下电泳，后在凝胶成像仪下检测总DNA的分子质量。

（3）PCR扩增检测。以ITS和psbA-trnH为目的片段进行PCR扩增，ITS引物使用特异性引物ITSF[16]（5-3）：GCGGTAGGATCATTGTCG，和通用引物ITS4（5-3）：TCCTCCGC TTATTGAT ATGC，psbA-trnH[17]片段使用引物psbA （5-3）：GTTATGCATGAACGTAATGCTC， trnH（5-3）： CGCGCATGGTGGATTCACAATCC。2个目的片段的扩增体系相同：反应体系30 μL，包括50 ng·mL-1 DNA模板1 μL，正反引物各1 μL，PCR Master Mix（昆明硕擎）15 μL，其余用水补齐。ITS反应程序为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35个循环，72 ℃延伸5 min； trnH-psbA反应程序与ITS基本一致，不同之处在于退火温度为58 ℃，35个循环内延伸时间为1 min。2个反应程序中的退火温度均由梯度试验获得。

2 结果与分析

2.1 总DNA的纯度检测结果

使用紫外分光光度计检测提取到总DNA的纯度，高纯度DNA的A260/A280值应该在1.8～2.0 [18]。当A260/A280<1.8时，DNA样品中可能存在蛋白质或者酚类物质的污染，当A260/A280>2.0时，DNA样品总可能含有较多的RNA。从表2可以看出，本试验所用3种提取植物总DNA的方法中，试剂盒法、改良CTAB法和改良SDS法所得总DNA的A260/A280值范围分别在1.90～1.97、1.87～2.01和1.88～2.03，3种提取方法总DNA的A260/A280值均大于1.8，说明蛋白质和酚类物质去除较为彻底，仅改良CTAB法和改良SDS法提取的新鲜样品YN的A260/A280值略大于2.0，可能是由于RNA的去除效果不好，影响了光吸收值导致的。在总DNA得率方面，改良CTAB法得率最高，其范围在20.25～27.70 μg；其次是改良SDS法，得率范围在17.75～22.56 μg；试剂盒法得率最低，其范围在12.78～14.91 μg。3种提取方法不同样品均以试验前1 h采集的样品YN得率最高，说明相同保存条件下，时间越久，样品的得率就越低。

2.2 总DNA电泳检测结果

从图1可以看出，3种不同提取方法的总DNA基本上都有一条明亮的高分子量条带，说明3种不同DNA提取方法都能够提取到完整的DNA。其中，新鲜样品YN条带明亮，无明显拖尾现象，说明总DNA基本没有降解；而硅胶保存的干样WY和NC均出现拖尾现象，说明总DNA出现了部分降解。

2.3 PCR扩增检测结果

DNA模板的质量对PCR扩增影响很大，故PCR扩增结果成为判断DNA质量的重要依据之一。将3种方法提取的总DNA浓度稀释到50 ng·μL-1用于PCR扩增，核糖体ITS和叶绿体psbA-trnH片段的扩增结果分别见图2和图3，所有的样品均扩增成功，每个样品只有一条明亮的带，各样品同一片段条带亮度无明显差别，扩增出的ITS和trnH-psbA片段大小分别在1 100 bp和800 bp左右。结果表明，3种不同方法提取的总DNA质量良好，均可用来进行后续试验。

3 结论与讨论

从提取得率来看，改良CTAB法>改良SDS法>試剂盒法；从总DNA电泳结果来看，新鲜样品YN的完整性更高，干样WY和NC都出现了不同程度的降解；从总DNA纯度方面来看，试剂盒法提取的总DNA纯度较高，改良CTAB法和改良SDS法提取的新鲜样品YN总DNA的A260/A280值略高于2.0，但从结合核糖体ITS和叶绿体psbA-trnH片段的扩增结果来看，没有影响到扩增的结果，满足一般分子生物学试验的需求。本试验研究结果表明，3种方法提取的DNA均可用于后期的分子标记，但考虑DNA提取的效率和后期扩增的效果，对于榧树属植物叶片，最后选择采取试剂盒法提取DNA。且近年来试剂盒法发展迅速，具有操作简单，毒害少，效率高，提取质量高等优点，随着试剂盒得率的增加，通用性的提升和价格的降低，将来会越来越受到大家的认可和青睐。

试验材料的保存时间和保存方式会直接影响到植物总DNA提取的质量，最好选用新鲜的植物叶片作为试验材料，但是西南地区野生的榧属植物大多生长在人类活动范围之外，且海拔较高，交通不便，故只能先将样品硅胶干燥保存；同时，采集到的样品保存时间越久总DNA降解越严重，为提高总DNA得率以确保后续试验的开展，应该尽快提取总DNA，将样品以DNA的状态保存于-80 ℃冰箱；植物总DNA的纯度与试验材料的保存时间关系不大，而与提取的方法有关；另外，在试验操作中要注意尽量减少机械性损伤叶片、研磨过程中样品要一直浸泡在液氮中等[11]。

本试验3种方法提取的总DNA可以满足一般的分子试验要求，但如果进行Southern Blot等深入的分子生物学试验，需根据不同植物特点进行探索，优化提取条件，尽可能去除样品中的蛋白质或酚类等杂质，以得到纯度更佳的总DNA。

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