乳品真菌污染及快速检测技术研究进展

杨同香 常小静 吴孔阳 费 鹏 陈俊亮 唐浩国 刘丽莉 康怀彬

(1. 河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；2. 河南三剑客农业股份有限公司,河南 漯河 462000；3. 洛阳师范学院生命科学学院，河南 洛阳 471934)

在食品加工和农业生产过程中，易受到真菌及其所产毒素危害，控制食品和饲料中霉菌和酵母菌数量仍然是一项重中之重的工作[1-2]。因此，尽早发现并确定微生物种类、数量、所产危害物质,监视以及抑制真菌生长等研究工作显得尤为重要[3]。乳及乳制品在生产加工过程中，由于受到原料乳质量、加工工艺、加工环境条件、生产人员技术水平等因素影响，会发生微生物污染事件，另外产品在冷藏、运输、销售等环节也容易被微生物污染。尽管通过一些预防和控制方法，比如生产质量管理规范(GMP)以及技术改进等，微生物污染问题仍然是生产商们面临的重要问题[4-5]。近年来，研究人员对乳及乳制品中常见食源性致病菌检测技术开展了广泛的研究，主要包括针对沙门氏菌[6]、蜡样芽孢杆菌[7]、阪崎肠杆菌[8]、李斯特菌[9]和志贺氏菌[10]等病原菌，同时对其检测技术进行了很好的归纳和分析[11-12]。针对乳及乳制品中常见真菌检测技术方面研究概述则相对较少，而真菌对乳及乳制品的污染问题依然不能忽视，对其快速检测技术开发一直以来也是相关研究人员关注的问题。因此，文章从乳及乳制品中常见的真菌类型、真菌污染概况、真菌检测技术及污染的质量控制等方面进行概述。

1 乳品中真菌污染概况

全球乳产量持续增长，2016年估计为4.988 2×108t，消费群体分布在不同年龄段[13]。然而乳制品易受多种因素影响而引起污染，比如金属、农药和微生物等。在乳品终端销售环节，因发现菌丝体污染引起的产品召回事件频发[14]。从李雨哲等[15]对中国东北地区市售干酪中霉菌、酵母的情况调查中也可以发现，大约有20%的干酪存在霉菌或酵母超过现行标准(GB 5420—2010)要求的现象。Shokri等[16]通过对伊朗亚兹德省7个农场的70份骆驼奶样进行分析，发现存在酵母、霉菌及黄曲霉毒素污染。其中鉴定的酵母主要包括假丝酵母属(占比48.2%)、红酵母属(占比22.3%)、丝孢酵母属(占比13.4%)，鉴定的霉菌主要是丝菌属(占比16.1%)。另外对奶样黄曲霉毒素检验分析，发现其中20份奶样存在污染，黄曲霉毒素的平均含量达到45.95 ng/L，最低和最高含量分别为5.19，150.17 ng/L。

通过传统平板分离培养和现代分子生物学技术的研究，发现受污染的乳及其制品中多源于酵母菌和丝状真菌存在而引起产品变质[17-19]。Kalamaki等[20]通过分子鉴定研究发现开菲尔粒中酵母菌包括10个属(Candidaspp.、Debaryomycesspp.、Galactomycesspp.、Issatchenkiaspp.、Kazachstaniaspp.、Kluyveromycesspp.、Pichiaspp.、Saccharomycesspp.、Wickerhamomycesspp.、Yarrowiaspp.)，酵母菌种类达14种。通过对各种动物乳、酸乳及奶酪中真菌的分离和鉴定，不难看出在乳品生产加工过程中，受酵母污染的乳品优势酵母种主要包括：Debaryomyceshansenii、Kluyveromycesmarxianus、Rhodotorulamucilaginosa、Saccharomycescerevisiae等。尽管有些乳制品中酵母数量适度增加，通常不会引起食品安全问题，但是普遍认为其是引起食物腐败的重要因素[21]。对于丝状真菌污染情况的研究也发现众多不同种属真菌的存在。Lopandic等[22]通过随机扩增多态性DNA-PCR技术(RAPD-PCR)对奶酪、黄油、酸奶、酸奶油等进行酵母菌的分离和鉴定研究，发现获得的513个菌株中，460个属于子囊菌酵母，53个属于担子菌酵母类。此外Buehler等[23]从原料奶、奶酪、酸奶等样品中分离得到361株真菌，进而对其ITS进行DNA测序，并经BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索和UNITE数据库(https://unite.ut.ee/analysis.php)比对分析，可将这些真菌划分为3门19属，占比最多的3个属分别是青霉属(25%)、德巴利酵母属(18%)和念珠菌属(9%)。Banjara等[24-25]研究同样发现，在奶酪中德巴利酵母属真菌所占比例最高，青霉属真菌也普遍存在。

实际上，原料乳及其制品在奶样采集、生产加工、贮藏、运输和销售等环节均可能出现真菌污染问题，比如在产品生产过程中，可能由于空气、包装材料、发酵剂、稳定剂等污染而引入真菌孢子进入酸奶中[14]。Kure等[26]为了找出引起挪威亚尔斯堡奶酪生产过程中霉菌污染的关键点，从不同的生产车间采集空气、牛奶、盐水、机器设备表面、塑料薄膜等样品，通常引起奶酪污染的P.commune、P.palitans、P.solitum以及P.roquefortiss.Roqueforti等霉菌，可以在采集的空气和机器设备表面样品中发现。研究人员[26]认为通过控制并提高车间空气质量，尤其是包装车间，对于降低霉菌污染事件的发生非常重要。在埃及乳制品市场，奶酪占比最大，对于奶酪生产商来讲，在奶酪贮藏期面临最大的威胁是霉菌污染[27]。由于生产工艺差别，有些类型的酸奶更容易引起微生物污染，像希腊风味酸奶，以其高蛋白(蛋白含量达9%～10%)、低脂等著称，通常比其他酸奶生产更复杂，因此在生产中也增加了微生物污染的风险[28]。当然还有研究人员[29]发现在温度较高的季节，加之缺乏有效的冷藏手段，乳品发生污染的可能性通常会更大些。

2 真菌的快速检测技术

通常情况下，由酵母菌污染引起的酸奶产品变质，主要可以通过产品外观、滋味、气味等进行初步判断，比如出现胀袋、酒香味，严重时在产品表面可看到酵母的菌落[30]。目前对于乳品中真菌的检测，传统检测手段是利用平板培养分离和鉴定的方法，检测时间通常为5～7 d，具有滞后性，一般很难满足实际生产的需要，且已有众多相关研究[31-33]，本文不再赘述，着重就微生物快速检测技术和分子生物学检测技术进行介绍。

2.1 流式细胞仪快速分析法

在水果制品行业，对于酵母和霉菌污染的评测是一项关键的指标，由Chemunex开发的一款ChemFlow细胞仪计数系统可以快速对水果制品中的微生物污染情况进行评测[34]。利用该系统可以在24～48 h内实现对10 g水果制品中含有1个及以上酵母细胞的检出水平，这也很适合用于水果风味酸奶样品中酵母的检测[35]。

2.2 微生物快速检测系统

随着微生物快速检测系统的完善和发展，乳及其制品中酵母菌和霉菌的检测手段也变得更加快捷。郑东辉[36]利用WKJ-Ⅱ微生物快速检测仪，该系统是基于计算机视觉技术检测乳制品中的细菌总数、酵母菌和霉菌。在上机测试过程中，通过比色法和微滤富集快速检测酸奶中酵母菌，通过微滤富集、涂片染色快速检测酸奶中霉菌。原铨[37]利用美国BioLumix微生物荧光光电检测系统对酸奶样品检测，可以将原先5～7 d的检测时间缩短至48 h，该检测系统通过染色技术监测霉菌和酵母菌代谢过程，将染色、新光源、光传感器结合在一起的光电检测系统。

2.3 分子生物学快速检测技术

通过分子生物学技术检测食品中的真菌，已经取得显著成效，并广泛应用于实际生产。目前主要有聚合酶链式反应技术(PCR)，并在此基础上开发了不同的PCR技术，比如反转录PCR(RT-PCR)、荧光定量PCR、单链构象多态性-PCR以及环介导等温扩增技术(LAMP)等[38-40]。这些技术都体现出对特定基因以及特异性引物的选择和设计，通过合理的试验设计，可以很好地扩增出所需要的目标DNA，从而利用相关分析方法，判断乳品中微生物菌群的数量和种类。

Vaitilingom等[38]利用RT-PCR扩增延伸因子(EF-Tu或者EF-1α)，实现了对巴氏杀菌奶中细菌、霉菌和酵母的检测。在4 h内，轻易检测出的细胞在10个/mL，另外还证实该方法可以用在酸奶、啤酒等产品中。Mayoral等[41]同样利用RT-PCR技术成功地检测出酸奶样品中有活性的马克思克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)，利用该方法可以检出酵母的下限为102CFU/mL。Mayoral等[30]还开发了一种利用PCR-培养技术检测酸奶样品活性的马克思克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)方法，通过对污染酵母的酸奶样品(不少于10 CFU/g)恒温振荡培养24 h，然后进行DNA提取，扩增18S rRNA，可以得到一个251 bp的特异性条带，而未培养的对照酸奶样品则检测不到目标条带。针对马克思克鲁维酵母，Kim等[39]报道了一种新颖的基于Taqman探针的荧光定量PCR技术，用于快速灵敏地检测开菲尔酸奶发酵过程中该酵母的污染情况，通过试验研究发现，利用该方法可以在2 h内检测出开菲尔酸奶中的马克思克鲁维酵母。相比之下，根据美国FDA细菌学分析手册所提供的标准培养方法用于检测乳制品中酵母的污染，至少需要5～7 d的分离培养时间以及另外2～3 d的时间用于基于基因测序和生化分析鉴定酵母，Kim等[42]所做的研究工作在乳品工业上具有更好的应用价值。另外通过叠氮溴化丙锭(PMA)结合qPCR对乳制品样品中活菌DNA进行定量也能快速检测发酵乳中酵母菌。盖冬雪[43]通过建立的PMA-qPCR方法与标准法(GB 19302—2010)检测酵母菌比较发现，发酵乳中酵母菌PMA-qPCR活菌检测结果与国标法符合率大于86.6%，检测时间约为4 h，该方法作为检测发酵乳中是否存在酵母菌的有力工具，适合乳品加工企业生产线的现场评价。

除此之外，Kasahara 等[44]建立了一种LAMP技术用于快速检测乳品中致病酵母菌(C.albicans、C.glabrata、C.tropicalis、T.asahii、T.mucoides、C.parapsilosis)，结果表明该方法灵敏、省时、高效，可以作为一种监测食品质量的简便快速方法。另外利用PCR技术还可以用于快速评估奶酪成熟过程中菌群的动态特征及比例，例如Callon等[45]借助单链构象多态性-PCR(SSCP-PCR)指纹图谱分析奶酪中酵母菌群情况，主要是通过设计酵母特异性引物，扩增18S rRNA 的V4区达到SSCP分析的目的。

3 乳及乳制品中微生物污染的质量控制

随着中国食品质量安全市场准入制度的建立，食品生产企业面临着严峻考验。对于很多生产企业来说，由于工艺装备简单，技术力量薄弱，控制微生物的污染成为工作的难点，其中温度控制是非常重要的[46]。Ombarak等[27]研究发现可以通过那他霉素和山梨酸钾的协同作用抑制霉菌的生长，从而延长奶酪的贮藏期。Ollé Resa等[47]研究则发现那他霉素对酵母菌也有很好的抑菌效果。此外，水活度是影响食品中真菌发育的非生物因素之一， Nguyen Van Long等[48]建立了基于氯化钠或甘油减少水活度的模型，阐述其在奶酪中对丝状真菌分生孢子萌发和径向生长的影响效果，结果表明通过氯化钠降低水活度能够显著起到抑制真菌效果。

4 展望

开发具有抗真菌活性的优良乳酸菌辅助发酵剂，不仅可以解决酸奶中霉菌和酵母菌污染的问题，还可以适当延长发酵乳制品货架期，有望成为提高酸乳产品稳定性及品质的一把利剑[49-51]。而作为监测乳品生产过程中是否存在真菌污染的检测技术，今后仍然有很多值得研究和探讨的地方。由于各个乳品生产企业规模、效益、技术水平有较大差异。经济实力雄厚的企业可以通过购置先进的微生物快速检测系统用于真菌风险评估，而对于中小型乳企业而言，受资金、技术及人才等因素影响，更希望获得简单、快速、低廉的检测方法。随着分子生物学技术的不断发展，利用荧光定量PCR可以很好地解决这一问题。今后可以进一步完善荧光定量PCR体系，比如筛选DNA结合试剂、开发其他引物用于检测更多潜在的微生物[52]。

随着新科学技术和工具的发展，比如全基因组测序技术将会给尚未认知的乳品微生物研究提供全新的视角，可以用来研究分析那些对产品质量或公众健康有风险的微生物[53]。本课题组已着手开展乳品中真菌分子标记的开发，借助新的测序技术，探索一种快速检测乳品真菌的方法，以期为乳品真菌污染检测提供新的思路。