食源性细菌耐药性检测方法的研究进展

张可欣

李忠海1, 2

任佳丽1, 2

(1.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004；2.稻谷及副产品深加工国家工程实验室，湖南 长沙 410004)

随着临床、畜牧业和养殖业对抗生素的滥用，导致世界范围内细菌对抗生素耐药问题日益严峻[1]。这些食源性耐药细菌有可能通过食物链将耐药性基因传递给人类，从而引起人类的感染。中国动物性食品源细菌耐药情况已很严重[2-4]。在中国，每年因食源性细菌感染发病人数可达9 411.7 万人次，病死人数8 564人，病死率0.009 1%[5]。为了从源头阻止污染耐药性细菌的食品流入市场，感染人类，快速测定食源性细菌的耐药性显得尤为重要。目前常用的药敏试验方法有扩散法和微量法等，但传统方法得到准确报告所需的时间太长，随着分子生物学和电化学技术等学科的发展，一些新型的快速药敏试验方法得到了发展。本文拟对目前常用的药敏试验方法和快速药敏试验方法的研究进展进行阐述。

1 常规药敏试验方法

1.1 扩散法

扩散法是利用待测药物在含菌平板上球形扩散的原理，离纸片(牛津杯或者孔)越近，抗生素浓度越高，越远抗生素浓度越低，随着抗生素浓度的降低，有一条最低抑菌浓度带，过夜培养后细菌不能生长，形成抑菌圈。纸片扩散法是通过测量抑菌圈的大小并根据CLSI(Clinical and laboratory standards institute)制定的“抗微生物药物敏感性试验执行标准”来判断细菌对该种抗生素的敏感程度。扩散法包括纸片法、牛津杯法和打孔法[6]。由于牛津杯法和打孔法的操作性和稳定性较差，且难以实现标准化，所以目前大多数实验室和临床药敏试验都采用纸片扩散法来获得定性的结果。梁丽红等[7]使用纸片扩散法调查食用卤制品中伦敦沙门菌的药敏；王萍等[8]使用纸片扩散法了解急性腹泻患者副溶血性弧菌的耐药情况。开发新的药敏试验方法中，也常与纸片扩散法的结果作对照，来保证新方法的准确有效性，如廖诗英等[9]在研究鸡大肠杆菌TTC快速药敏试验方法过程中，选用纸片扩散法作为标准对照方法。

这种方法具有操作简便，成本低廉等优点，但至少需要16～18 h的培养时间才能得到结果，且因为试验结果容易受到诸多因素，例如pH、平板厚度等的影响，所以必须严格按照CLSI的操作章程试验，同时使用质控菌株进行平行试验。

1.2 稀释法

稀释法判断细菌药物敏感性的原理是根据细菌在一系列含有二倍稀释浓度抗生素的培养物中的生长情况，肉眼观察无明显细菌生长的培养器中所含药物的最低浓度就是最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration，MIC)。MIC值越小，说明细菌对该种抗生素越敏感。根据培养物的不同分为肉汤稀释法和琼脂稀释法，根据培养物量的不同，又分为常量法和微量法[10]。稀释法可以得到对临床用药有指导意义的MIC值，可以在定性的同时又定量。李月婷等[11]使用微量肉汤稀释法对食源性沙门菌进行药敏试验，结果表明27株受试沙门菌全部对头孢西丁敏感；肖丹等[12]和李顺姬等[13]使用微量肉汤稀释法分别研究了沙门氏菌和致泻大肠杆菌的耐药性，结果表明66株沙门菌和41株致泻大肠杆菌对测试的8种抗生素均有不同程度的耐药，MIC值为4～608 μg/mL 不等。

稀释法可以同时试验多种菌，对抗生素的选择也比较自由，是临床中常用的药敏试验方法，但该方法同纸片扩散法一样，也需要将试验菌和质控菌进行平行试验，当质控菌的结果符合标准，试验菌的结果才可靠，且该方法至少需要16～20 h才能得到结果，且MIC值的准确判断对操作人员的要求较高。

1.3 Etest法

Etest法是浓度梯度琼脂扩散试验，既结合了扩散法和稀释法的特点和原理，又弥补了二者的不足[14]。E试条一面固定有不同浓度的药物，另一面标有药物浓度的刻度，将E试条含有药物的一面置于含菌平板上过夜培养后，在试条周围可见明显的椭圆抑菌圈，通过读取圈边缘与E试条相交的刻度可以得到抗菌药物抑制细菌的最小抑菌浓度。沈赟等[15]同时使用微量肉汤稀释法和Etest法判断食源致病菌的MIC值，结果表明2种方法重复性好；秦思等[16]使用Etest法对江苏地区食源性致病菌进行耐药分析，结果表明63株金黄色葡萄球菌对红霉素耐药率最高，为33.3%，多重耐药率为3.2%；Cantón等[17]同时使用微量肉汤稀释法和Etest 法对金黄色葡萄球菌进行药敏试验，结果表明2种方法具有良好的重复性。

Etest法继承了纸片扩散法优点的同时，也具有定量的优点，与微量肉汤法相比，MIC值易判读。以上3种传统药敏试验方法都是基于细菌生长的原理，需过夜培养，获得试验结果所需时间较长。

2 快速药敏检测系统

目前有3种常用的药敏自动检测系统，分别是德国西门子的MicroScan WalkAway系统、法国梅里埃的Vitek系统和美国BD公司的Phoenix系列自动化仪器[18]。3种检测系统都是基于微量肉汤稀释法的原理，集成了标准浓度细菌悬液的配制、接种、培养、菌株生长情况测定及报告MIC值5个步骤于一体，具有快速、便携的优点[6]。

孙宏莉等[19]调查中国425所使用Vitek-2药敏检测系统的医院微生物实验室的测试准确率，结果表明中国Vitek-2细菌药敏检测系统中氨苄西林/舒巴坦、头孢替坦、头孢曲松、美罗培南和头孢吡肟的药敏检测结果一致性和准确性较低，其他抗菌药物的药敏结果均具有很好的一致性和较高的准确性；魏丹丹等[20]将临床分离的可疑耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)124株随机分别用Vitek-2 COMPACT和MicroScan WalkAway 40 SI全自动微生物鉴定仪进行细菌鉴定及药敏分析，同时用PCR方法对照，评价2台细菌分析仪检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的灵敏度、特异度和符合率，结果表明2台全自动微生物分析仪与PCR方法检测得到的结果一致；Erika等[21]用MicroScan方法测定了柬埔寨人血液中沙门氏菌对阿奇霉素和环丙沙星的耐药性。

药敏自动检测系统的优点是在药敏结果的数据报告、分析及传递方面的便捷性及准确性，减少了人力，缺点是仪器体积庞大不便携，且购买仪器所需的费用昂贵，加上维修成本高导致使用成本高。

3 辅以显色剂的药敏试验方法

具有代谢活性的细菌能产生ATP、水解酶以及氧化还原酶，创造出利于还原的环境，能够直接或者间接地还原显色剂，显色剂颜色或者荧光的改变代表了细菌的活性[22]。细菌与抗生素以及反映代谢活性的显色剂(如亚甲基蓝和刃天青)一同培养，耐药细菌会持续繁殖、代谢显色剂导致颜色变化，而敏感细菌则不会，以此来判断细菌的药物敏感性。林丽英等[23]研究亚甲基蓝还原法测定结核分枝杆菌的药物敏感性，并将结果与传统的绝对浓度法进行比较，2种方法测得MIC值的相同率较高；孙怀昌等[24-26]研制出一种以刃天青为指示剂的微量板，能够快速诊断奶牛乳腺炎葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌的药敏试验，在12 h内获得与纸片扩散法一致的药敏试验结果；Deiss等[27]研制出一种以刃天青为指示剂的便携式大肠杆菌药敏试验纸板，具有与纸片扩散法类似的性能、重复性和预测性；Kadlec等[28]基于手机摄像头将其改造成微光度计，研制出一种以水溶性四唑盐(WST-8)为指示剂的快速便携药敏试验方法，通过调整细菌与WST-8的作用时间可以直接测定初始浓度101～106CFU/mL 的细菌，省略了菌液的前处理步骤，将抗生素预涂于容器表面，也解决了有限资源下快速药敏试验的问题。

这种基于指示剂颜色变化来判断细菌药物敏感性的方法不仅可以肉眼观察进行定性检测，也可以使用分光光度计进行定量检测，具有直观，操作简单的优点，可以缩短药敏试验的时间，但人工肉眼判别具有一定的主观性，而分光光度计又不便于携带。

4 电化学方法

近年来，在细菌的电化学超灵敏检测中已有了最新进展[29-31]，但只有学者研究抗生素敏感性的直接电化学检测。电化学方法检测细菌药物敏感性的原理是：细菌的呼吸作用主要依靠呼吸链的电子传递，巧妙引入氧化还原探针介入细菌呼吸链，呼吸链活动产生的电化学变化可以用电化学的方法快速而可靠地检测到。

国外已有此类研究。Ertl等[32-33]利用铁氰化钾作为氧化还原探针，将大肠杆菌与抗生素作用15 min后，与铁氰化钾的溶液混合，用计时电量法测定电信号，结果与传统纸片扩散法完全一致，这种方法能在少于25 min的时间内提供报告，但用电化学方法测得的IC50值比标准浊度法得到的结果要高100倍，且试验过程中发现电极对抗生素有吸附作用，影响试验结果；Chotinantakul等[34]在Ertl等的基础上，改进了试验方案：大肠杆菌与细菌作用后离心除去抗生素，之后重悬于含有铁氰化钾的测试液中，该方法能在3～6 h给出药敏试验结果。

以上的研究均基于大电极系统，随着微机加工技术的发展，电极尺寸可微缩至微米乃至纳米级别，为便携式耐药细菌快速检测系统的研制提供了技术支撑。Besant等[22]将菌液体积限制在2.75 nL的容器中，通过使用电化学检测刃天青的还原来检测细菌代谢活性，提出了一种快速电化学药敏试验方法能够在1 h内报告细菌的药物敏感性；Choi等[35]使用了一种微流体琼脂糖系统(MAC)，通过琼脂糖固定单个细胞后，使用显微镜观察在不同抗生素存在时的生长情况，只需3～4 h就能给出与CLSI相匹配的MIC值。中国的何佳芮[36]研究构建了一种集细菌快速检测和快速药敏分析为一体的微流控芯片，能够在30 min内完成对1 μL样本中E.coliO157：H7的检测，检测限为101～105CFU/μL，并在4～8 h 完成对不同浓度下，3种抗生素的药敏试验。

电化学方法具有快速、灵敏、低能耗和低成本的优点，在开发快速便携的药敏试验方法方面具有广阔前景。

5 分子生物学技术

分子生物学技术包括PCR技术、基因芯片法、全基因组测序等[37]。运用分子生物学技术进行药敏试验，主要是从基因层面对耐药基因进行的检测。

5.1 PCR技术

PCR技术包括普通PCR和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)[38]，可以用于鉴定和定量分析临床标本中的病原菌，以及检测病原菌中的耐药基因，具有灵活、快速的优点[39]。目前，已经可以通过PCR技术检测mecA和(或)mecC基因来鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)[40]；还有人[41-42]运用PCR技术通过检测与万古霉素耐药基因相关的vanA和vanB基因来快速检测肠球菌的耐药性。李坚等[43]设计并合成荧光定量PCR引物，绘制荧光定量PCR标准曲线，以荧光定量PCR方法测定细菌在抗生素作用下生长不同时间基因组DNA含量，并与纸片(K-B)法进行比较，建立了葡萄球菌快速药敏试验方法，结果与纸片扩散法一致。

5.2 基因芯片技术

基因芯片的测序原理是杂交测序法，即未知序列通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，具有快速、特异、高通量的特点，运用该技术检测细菌耐药性，可以在1个工作日内提供报告[37-38]。欧维正等[44]通过比较基因芯片法和比例法在检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的药物敏感性试验中的符合率，发现基因芯片较比例法有更高的敏感性和特异性，对多重耐药性结核杆菌的快速诊断具有重要临床价值；Naas等[45-46]的研究表明，在最新的升级版芯片中可一次性检测3种超广谱β内酰胺类耐药基因，6种质粒介导的头孢菌素类耐药基因和5种碳青霉烯类耐药基因，经临床菌株验证显示，敏感性和特异性均为100%。

5.3 全基因组测序

全基因组测序可以得到样品的完整序列，可获得大量信息。朱健铭等[47]运用全基因测序法分析肺炎克雷伯菌JM45株对喹诺酮类药物耐药基因；王登峰[48]基于Hiseq 2000和PacBio SMRT技术的测序数据，使用de novo拼接方法获得多重耐药MRSA菌株Z35和Z43的全基因组序列并进行SCCmec特征分析，结果显示Z35为ST9-SCCmec Ⅶ，携带重组酶基因复合体ccrC2；Z43为ST97-SCCmec Ⅳ，含有多种耐药基因。

分子生物学方法与传统药敏试验法不同，传统药敏试验方法是对菌株耐药表型的检测，而分子生物学方法是基因层面对耐药基因进行的检测[6]。PCR技术检测耐药基因具有快速灵敏度高的特点，但一次检测的耐药基因有限，且容易出现假阴性结果；基因芯片法能一次检测多种耐药基因，具有快速、灵敏度高和特异性高的特点，但在检测新的或不典型的耐药基因时具有局限性，且价格昂贵；全基因组测序能够发现尽可能多的耐药机制，是细菌耐药机制研究的重要手段，但不适合临床和耐药性检测、监测中的推广应用[49]。以上3种分子生物学方法都不能对临床治疗提供有指导意义的MIC值[37]。

6 展望

以快速、灵敏和便携的耐药细菌鉴定技术可有效避免污染食品的进一步流通，是研究的方向和热点。传统药敏试验方法作为“金标准”，具有完善的标准体系，但所需时间长(通常24～48 h)；快速药敏检测系统减少了人工操作，但仪器庞大且成本较高，难以做到便携；分子生物学技术具有高通量、快速和特异性高的特点，但在检测新的和不典型耐药基因时具有局限性；基于电化学方法的微流控技术具有快速、灵敏、微型的特点，如能突破稳定性和可回复性因素的影响，将是未来生物检验发展的方向。

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