下调miR-21抑制PI3K/AKT信号通路对白血病细胞增殖凋亡的影响①

严匡华 陈 龙 严风梦

(河南大学第一附属医院血液科，开封 475001)

白血病又称血癌是一种常见儿童期好发性的血液系统恶性肿瘤，是我国主要肿瘤死亡因素之一，其主要特征为造血干细胞异常增殖、分化、凋亡和造成正常血细胞减少[1，2]。从2002年～2014年的研究发现，部分地区白血病的发病率和死亡率有明显上升的趋势，严重威胁着人们的健康[3，4]。目前化疗是白血病临床治疗的主要手段，但其往往伴有较大的副作用，寻找安全有效的治疗手段一直是研究的热点[5，6]。微小RNA(miRNA)是一种小分子RNA，在白血病中发挥着癌基因或抑癌基因的重要作用，研究特定的miRNA可作为白血病诊断和治疗的有效靶点[7，8]。研究发现miR-21在多种肿瘤中呈现异常表达，干扰其表达可达到抑制肿瘤细胞生长的目的[9，10]。目前，关于miR-21在白血病中的作用机制尚不明确，本实验通过下调miR-21的表达，观察其对白血病K562细胞增殖凋亡的影响，及其对PI3K/AKT信号通路的调控作用，探讨miR-21在白血病细胞中可能的作用机制，为白血病的靶向治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1材料 RPMI1640培养基和胰蛋白酶购于美国Hyclone公司；胎牛血清购于浙江四季青公司；白血病细胞系K562购于上海中国科学院细胞库，miR-21和内参U6的引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；miR-21 inhibitor和miR-21 negative control购于广州锐博生物科技有限公司，脂质体LipofectamineTM2000、BCA蛋白定量试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒、总RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购于美国Invitrogen公司；噻唑蓝MTT、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒和聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购于美国Sigma公司；兔抗PI3K、p-AKT、AKT、β-actin抗体和羊抗兔HRP酶标记的IgG购于美国Santa Cruz公司；流式细胞仪和酶标仪均购于美国Bio-Rad公司；PCR扩增仪购于美国Gibco公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养、分组和转染 将K562细胞培养中含有10%胎牛血清和青链酶双抗(100 U/ml青霉素+100 μg/ml 链霉素)的RPMI1640培养基上，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中常规培养。取对数生长期细胞，分为对照组(不做任何处理)和miR-21 NC组(加入120 nmol/L miR-21 negative control+脂质体)和miR-21干扰组(120 nmol/L miR-21 inhibitor+脂质体)3组。按照脂质体转染的说明书将上述各组细胞进行转染，转染后继续培养6 h，更换成完全培养基，在常规条件下继续培养，待培养48 h后收集细胞进行后续实验。

1.2.2qRT-PCR检测miR-21 mRNA的表达 收集上述转染48 h的各组K562细胞，按照总RNA提取试剂盒的说明书提取各组细胞的总RNA，BCA法检测其浓度和纯度后，再按照逆转录试剂盒说明书将总RNA逆转录为cDNA，参照GenBank中miR-21序列，利用Primer premier 5.0软件设计目的基因miR-21及内参基因U6的RT-PCR引物，以cDNA为模板进行PCR扩增。反应程序为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，35个循环，72℃总延伸5 min。反应体系为20 μl，以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算各组细胞中miR-21 mRNA表达水平。

1.2.3MTT法检测K562细胞增殖 取转染48 h后的各组K562细胞，以3×105个/ml浓度接种至96孔板中，每孔加入100 μl细胞悬液后在条件为37℃、5%CO2的二氧化碳培养箱中培养48 h。其中每组实验均设5个复孔，每孔加入新鲜噻唑蓝MTT溶液(浓度为5 mg/ml)20 μl，孵育4 h后加入二甲基亚砜DMSO 200 μl，待充分溶解后用酶标仪于570 nm检测各组细胞的吸光值(OD)。根据公式：细胞增殖率=(转染组细胞OD/对照组细胞OD)×100%,计算各组细胞的细胞增殖率。

1.2.4流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡 取转染48 h的各组细胞经胰蛋白酶消化后，调整细胞浓度为3×104个/ml，经离心、PBS洗涤和75%乙醇处理后，加入200 μl结合缓冲液Binding Buffer重悬细胞，再加入膜联蛋白-V-异硫氰酸荧光素(Annexin-V-FITC) 5 μl和碘化丙啶(PI)10 μl，避光处理30 min后，上流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期和细胞凋亡率。

1.2.5Western blot检测信号通路PI3K/AKT中相关蛋白的表达 收集转染48 h后的各组细胞，加裂解液提取总蛋白，并采用BCA法检验其浓度。取100 μg上清蛋白量进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(12%)电泳，转聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，经脱脂奶粉(5%)封闭2 h后加入兔抗PI3K、p-AKT、AKT和β-actin抗体(稀释1∶1 000)，孵育4℃过夜，再加入稀释1∶1 000的二抗羊抗兔HRP酶标记的IgG(IgG-HRP)，孵育2 h后，以化学发光法显色，用凝胶电泳成像仪采集图像。以β-actin为内参，采用Quantity One软件分析条带。

2 结果

2.1转染后各组细胞中miR-21的相对表达水平 qRT-PCR检测转染后各组K562细胞中miR-21的表达结果见图1，对照组、miR-21 NC组和miR-21干扰组细胞中miR-21的相对表达水平分别为(1.00±0.03)、(0.98±0.05)和(0.32±0.05)。与对照组相比，miR-21 NC组细胞中miR-21的表达水平无明显变化(P>0.05)，而miR-21干扰组细胞中miR-21的表达水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2下调miR-21对白血病细胞增殖的影响 转染48 h后，对照组、miR-21 NC组和miR-21干扰组K562细胞的存活率分别为(100.18±2.15)%、(97.32±3.62)%和(52.45±5.25)%。结果如图2表明，与对照组相比，miR-21 NC组中细胞存活率的差异无显著统计学意义(P>0.05)，而miR-21干扰组中细胞的存活率显著降低(P<0.05)，表明下调miR-21的表达后明显抑制了K562细胞的增殖。

2.3下调miR-21对白血病细胞周期的影响 表1显示，与对照组相比，转染48 h后miR-21干扰组细胞中G0/G1期所占细胞比例显著升高(P<0.05)，S期细胞所占比例显著下降(P<0.05)，而miR-21 NC组细胞中各细胞周期变化不明显(P>0.05)。结果说明下调miR-21的表达可将细胞周期阻滞在G0/G1期。

2.4下调miR-21对白血病细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测转染48 h后各组细胞的凋亡结果见图3对照组、miR-21 NC组和miR-21干扰组中细胞的凋亡率分别为(6.78±2.25)%、(7.36±3.22)%和(35.42±2.25)%。miR-21 NC组细胞的凋亡率与对照组相比差异无显著统计学意义(P>0.05)，而miR-21干扰组细胞的凋亡率较对照组明显升高(P<0.05)。说明下调miR-21能够促进K562细胞凋亡。

2.5下调miR-21抑制PI3K/AKT信号通路 转染miR-21 48 h后，检测各组K562细胞中PI3K/AKT信号通路中PI3K、AKT和磷酸化AKT蛋白的表达情况，结果见表2、图4。与对照组相比，miR-21NC组细胞中PI3K、t-AKT和p-AKT蛋白的相对表达水平差异均无显著统计学意义(P>0.05)，而miR-21干扰组中PI3K和t-AKT的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，但p-AKT的表达水平明显下降(P<0.05)。

图1 转染后各组细胞中miR-21的相对表达水平Fig.1 Relative expression levels of miR-21 in cells after transfectionNote:Compared with control,*.P<0.05.

图2 下调miR-21对白血病K562细胞增殖的影响Fig.2 Effect of down regulation of miR-21 expression on proliferation of leukemic K562 cellsNote:Compared with control,*.P<0.05.

GroupsG0/G1SG2/MControl56 08±1 8632 25±1 0611 88±1 25miR⁃21NC57 16±2 352)31 52±2 552)11 76±1 122)miR⁃21interference69 86±2 111)20 21±1 121)10 02±2 021)

Note：Compared with control,1)P<0.05;compared with control,2)P>0.05.

图3 下调miR-21表达对K562细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of down regulation of miR-21 expression on apoptosis of K562 cellsNote:A.Control group；B.miR-21 NC group；C.miR-21 interference group.

GroupsPI3Kp⁃AKTt⁃AKTControl0 41±0 030 18±0 020 52±0 03miR⁃21NC0 42±0 052)0 16±0 032)0 51±0 042)miR⁃21interference0 38±0 051)0 07±0 031)0 49±0 051)

Note：Compared with control,1)P<0.05;compared with control,2)P>0.05.

图4 下调miR-21表达对PI3K/AKT信号通路的影响Fig.4 Effect of down regulation of miR-21 expression on PI3K/AKT signaling pathway

3 讨论

miR-21是一种广泛存在的定位于17q23.2染色体中FRA17B常见脆性区域上的miRNA[11]。研究发现，miR-21在胶质瘤、乳腺癌和宫颈癌等多种肿瘤中出现高表达，与肿瘤的发生发展密切相关，作为肿瘤标志物对肿瘤的诊断、治疗及预后评估具有很大的临床应用价值[12-14]。如Zhang等[15]研究发现过表达miR-21作为致癌基因在多发性骨髓瘤细胞增殖中发挥作用，并认为miR-21可能作为判断患者预后不良的指标；Bao等[16]检测miR-21在结肠癌及其相应癌旁正常组织的表达发现，miR-21在结肠癌中的表达水平较其癌旁正常组织明显上调，并认为其表达与结肠癌的发病位置、临床分期和淋巴转移密切相关。白血病是一种严重威胁儿童生命的恶性肿瘤，其发病机理仍不清晰，有研究发现miR-21在急性B淋巴细胞白血病中异常表达，与白血病的发生发展关系密切[17]，但关于miR-21与白血病的作用机制尚不明确，研究miR-21在白血病中的作用机制对白血病的诊断和治疗具有重要意义。

周克兵等[18]发现下调鼻咽癌中高表达的miR-21后，可有效抑制鼻咽癌CNE2细胞增殖和侵袭。Yu等[19]在miR-21对肾癌细胞凋亡和侵袭力的影响研究中发现沉默miR-21可抑制肾癌的恶性发展。为了探讨miR-21在白血病中的作用机制，本实验通过脂质体法下调miR-21的表达，观察其对白血病K562细胞增殖凋亡的影响，发现下调miR-21的表达能够明显抑制K562细胞的增殖，同时使细胞周期阻滞在G0/G1期，并促进细胞凋亡。此结果进一步证明了Wu等[20]得出抑制miR-21表达能够抑制白血病细胞增殖的实验结果，但本研究也发现 miR-21的表达可调控白血病K562细胞周期，此结果与Xiong等[21]研究抑制miR-21的表达可影响结肠癌HCT116细胞周期的结果相吻合。

磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用，磷酯酰肌醇-3激酶(PI3K)的激活能够促进细胞增殖和抑制细胞凋亡，蛋白激酶B(PKB又称AKT)是PI3K下游重要的靶激酶，两者均为PI3K/AKT信号通路的重要组成部分，在多种肿瘤疾病中发挥着重要作用[22，23]。PI3K/AKT在白血病中发挥着重要的调控机制，与白血病的发生发展密切相关[24，25]。Mu等[26]研究发现，下调miR-21的表达可以抑制人增生性瘢痕成纤维细胞中PI3K/AKt信号通路；Wang等[27]也发现沉默miR-21通过阻断PI3K/AKT信号通路来诱导白血病干细胞凋亡。为了进一步了探讨下调miR-21对白血病细胞凋亡的机制，观察其对白血病细胞中PI3K/AKT信号通路的影响，Western blot检测发现p-AKT的表达水平较对照组和miR-21 NC组明显下降，但PI3K和AKT蛋白的表达水平变化不大。

综上所述，下调miR-21能够抑制白血病K562细胞的增殖，使细胞周期阻滞在G0/G1期，促进其凋亡，其作用机制可以与抑制PI3K/AKT信号通路有关，本研究为以miR-21为分子靶点治疗白血病的实验研究提供了理论参考。

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