黄芪多糖抑制小鼠EAE及调控BV-2神经小胶质细胞活化的实验研究①

马金昀 王金英 孙 宇 李国陵 程晓东

(上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院临床免疫研究所，上海 200437)

多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)是一种由自身免疫反应所介导的慢性中枢神经系统疾病，其最经典和最成熟的动物模型是实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)[1]。MS/EAE以自身反应性T细胞活化、炎症、髓鞘脱失及神经元损伤和缺失为主要病变特点[2]。MS/EAE的发病机制极其复杂，近年来研究发现，神经小胶质细胞(Microglia,MG)活化释放大量前炎症因子和毒性介质，发起炎症反应并进一步扩大炎症范围和神经损伤程度，在MS/EAE的发生发展中发挥了至关重要的作用[3,4]。程序性细胞死亡配体(Programmed death ligands,PD-Ls)为B7-CD28超家族的新成员，表达于抗原提呈细胞上，与表达在T细胞上的受体——程序性细胞死亡分子-1(Programmed death-1，PD-1)相互结合并作用，发挥负向免疫调控作用,对调控机体自身免疫反应至关重要[5]。中枢神经系统(Central nervous system,CNS)中的神经小胶质细胞作为抗原提呈细胞，炎症反应时其表面的PD-L1表达升高，说明其在CNS炎症反应中发挥重要作用[6]。中药黄芪具有补中益气、升阳举陷、固表止汗等功效，临床上运用黄芪治疗神经退行性疾病有着悠久的历史，长期以来已进行了许多富有成效的探索[7-9]。本实验室已发现并报道，黄芪对小鼠EAE具有明显的治疗作用，可以明显改善EAE症状，抑制MOG诱导的脾脏T细胞增殖，降低促炎细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-17水平，增加抗炎细胞因子IL-4水平，减轻小鼠CNS炎性细胞的浸润和髓鞘脱失[10]。黄芪多糖(Astragals polysaccharides，APS)作为黄芪的主要有效成分，既有免疫增强作用，同时也存在免疫抑制作用，能双向调节免疫系统功能[11]。因此，为了进一步探索黄芪治疗EAE的神经免疫调控机制，在前期工作基础上，本研究将观察黄芪有效成分APS对小鼠EAE的治疗作用，以及对BV-2神经小胶质细胞活化的分子调控机制，以揭示APS的中枢神经免疫药理学机制，探寻其治疗多发性硬化的新靶点，为治疗神经退行性疾病提供科学实验依据。

1 材料与方法

1.1材料 SPF级雌性C57BL/6小鼠，8～9周龄，体重18～20 g，购于中国科学院上海实验动物中心，生产单位许可证号SCSK(沪2007-0005)；饲养于同济大学实验动物中心，动物使用许可证号SYSK(沪2009-0022)。BV-2小鼠小脑胶质瘤细胞，购于上海复祥生物科技有限公司；LPS购于Sigma公司；APS购于西安鸿生生物技术有限公司，纯度70%(批号111013)；髓鞘少突胶质细胞糖蛋白MOG35-55多肽由上海吉尔生化有限公司合成Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Ser-Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys，缩写MEVGWYRSPFSRVVHLYRN-GK，纯度>98%；完全弗氏佐剂CFA购于Sigma公司；结核分枝杆菌H37Ra(TB)购于BD公司；百日咳毒素(PT)购于Calbiochem公司；RPMI1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自HyClone公司；TNF-α检测试剂盒、IFN-γ检测试剂盒购自R&D公司；PD-L1检测试剂盒购自上海嘉硕生物科技有限公司；全蛋白提取试剂盒、Broadford法蛋白质浓度测定试剂盒购自生工生物工程有限公司；SDS-PAGE上样缓冲液、广谱彩虹预染Marker、eECL高灵敏度化学发光检测试剂盒购自康为世纪公司；FastQuant cDNA第一链合成试剂盒、SuperReal荧光定量预混试剂(增强版)购自天根生化科技有限公司；抗小鼠PD-L1单克隆抗体、抗小鼠β-actin抗体购自上海睿迪生物科技有限公司；噻唑蓝MTT、DMSO 购自Sigma公司；青霉素-链霉素双抗购自HyClone公司；75%酒精购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2方法

1.2.1动物造模、分组及给药观察 小鼠造模：MOG35-55溶于PBS缓冲液，终浓度2 mg/ml；在CFA中加入TB至终浓度5 mg/ml；MOG35-55溶液与CFA按体积1∶1 进行乳化，PT溶液的配制：将0.2 mg/ml PT用PBS缓冲液稀释至1 000 ng/ml；在免疫当日(d 0)乙醚麻醉小鼠，于背部脊柱两侧分两点注射MOG35-55乳化剂200 μg/只，腹腔注射PTX溶液200 ng/只，并观察小鼠麻醉后苏醒状态是否良好；在免疫后第2天(d 2)再次腹腔注射PT 200 ng/只。EAE小鼠症状评分标准根据国际通用的5级评分法[12]：无异常表现0分；部分尾部瘫痪0.5分；尾部完全瘫痪1分；后肢轻度瘫痪或步态不稳2分；后肢完全瘫痪3分；双后肢完全瘫痪，前肢轻度瘫痪3.5分；四肢完全瘫痪4分；濒死状态4.5分；死亡5分。小鼠分组及给药：实验前将所有小鼠称重，以g为单位根据体重分层，按顺序随机抽取各层小鼠，分为3组：a.正常组，蒸馏水0.2 ml/d灌胃，n=5；b.EAE组，蒸馏水0.2 ml/d灌胃，n=15；c. APS组，予APS 500 mg/(kg·d)灌胃，从免疫当日起直至观察终点，n=15。根据EAE小鼠症状评分观察APS的药效。

1.2.2BV-2神经小胶质细胞培养及活化模型的建立 BV-2细胞培养采用完全培养基：79%RPMI1640+20%灭活血清+1%青-链霉素双抗，培养条件：37℃、5%CO2。活化模型建立：取对数生长期的BV-2细胞，离心后弃上清，重悬细胞，稀释，调整细胞密度为104个/ml。取出6孔板，每孔加入2 ml细胞悬液，放入培养箱中培养24 h后，取出后加入不同浓度的LPS(用PBS溶液配备)，同时设置对照组，然后将细胞放入培养箱继续培养24 h后取出，放在倒置显微镜下观察细胞形态。MTT法检测细胞活性及毒性：活细胞数目与生成的蓝色结晶物甲瓒数量呈正比例关系，甲瓒在二甲基亚砜(DMSO)中溶解显色，根据显色程度可知甲瓒的数量，从而反应活细胞的数目，进而了解细胞增殖的情况。

1.2.3细胞分组及给药 设置对照组、LPS组、APS组、LPS+APS组，APS设置不同浓度。APS溶液的配置：称取1 g APS，溶解于50 ml PBS溶液中，制成20 mg/ml的APS母液，经滤器过滤除菌后保存于4℃冰箱。使用前用无菌PBS稀释至指定浓度。

1.2.4ELISA法检测BV-2神经小胶质细胞TNF-α、IFN-γ表达水平 按照ELISA试剂盒说明书操作。

1.2.5Western blot法检测BV-2神经小胶质细胞PD-L1的蛋白表达 采用考马斯亮蓝法常规测定样品蛋白浓度。经SDS PAGE凝胶电泳分离蛋白组份后，将蛋白转印于PVDF 膜上，经5% 脱脂奶粉封闭过夜后，分别加入不同一抗室温孵育2 h，再加入HRP 标记的二抗室温孵育2 h，显色后在成像系统中扫描并分析结果。

1.2.6Real-time PCR方法检测BV-2神经小胶质细胞PD-L1的mRNA表达 按照试剂盒说明书提取总RNA，反转录为cDNA。所用基因引物合成及扩增片段：β-actin:Sense:5′-AGAAGGTGGTGAAGCAGGCATC-3′，Antisense:5′-CGAAGGTGGAAGAGTGGGAGTTG-3′；PD-L1:Sense:5′-TTGGGAAATGGA-GGATAAGA-3′，Antisense:5′-GGATGTGCCAGAGGTAGTTCT-3′。采用20 μl 体系，按照试剂盒推荐方案于ABI7500 Real-time PCR仪中进行Real-time PCR 反应，结果采用相对定量法进行分析。

2 结果

2.1APS对EAE小鼠症状的影响 经MOG35-55诱导，EAE模型组小鼠发病起始于造模后第11天，发病高峰出现于造模后第16天，16 d后病情逐渐进入缓解期；EAE 组小鼠临床症状评分最高为3.5分，小鼠相继出现少食、少动、精神萎靡、皮毛干枯、尾部瘫痪、后肢无力、后肢瘫痪、前肢无力等症状；APS组小鼠发病时间及发病高峰期基本与EAE组无明显差异，但其高峰期临床症状评分为1.8分，较未治疗组明显减轻。说明APS对于EAE小鼠的临床症状具有明显的缓解作用，提示APS可以有效治疗EAE(图1)。

图1 APS对EAE小鼠临床症状的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of APS on clinical symptom of EAE mouse

2.2APS对BV-2细胞活化作用的影响 通过文献资料的查阅，在本研究中选择了3个LPS刺激浓度，分别为0.1、1、10 μg/ml，通过与正常组相比较发现，在不同浓度的LPS的刺激下，神经小胶质细胞的形态都发生了显著变化。正常组神经小胶质细胞呈分枝状，胞体小，多为三角形或扁椭圆形，突起长而纤细。LPS刺激后的神经小胶质细胞呈圆形，突起数量减少且短粗，为阿米巴样神经小胶质细胞，其中0.1 μg/ml的LPS刺激后，活化的神经小胶质细胞生存率较高。如图2所示,因此在后面的刺激活化实验中均采取0.1 μg/ml的LPS。

图2 不同浓度的LPS对BV-2细胞的活化作用Fig.2 Effect of different concertration of LPS on activation of BV-2 cellsNote:A-D.The morphology of the microglia after the intervention of LPS in different concentrations.A.Normal BV-2 cells;B.0.1 μg/ml LPS;C.1.0 μg/ml LPS;D.10 μg/ml LPS.

图3 APS抑制BV-2细胞活化Fig.3 APS inhibited BV-2 cell activationNote:A-D.The morphology of the microglia after treatment with APS.A.Normal BV-2 cells;B.0.1 μg/ml LPS;C.0.2 mg/ml APS;D.0.1 μg/ml LPS and 0.2 mg/ml APS.

APS对活化的神经小胶质细胞影响， 图3A为未经LPS活化BV-2细胞，图3B为0.1 μg/ml LPS活化BV-2细胞，图3C为0.2 mg/ml 的APS直接干预BV-2细胞，观察APS对未经LPS活化的神经小胶质细胞影响，图3D为0.1 μg/ml LPS活化BV-2细胞后，加入0.2 mg/ml 的APS观察BV-2细胞的形态学变化。结果显示，APS组与对照组相比，细胞形态没有明显的变化，LPS+APS组与对照组相比，呈圆形，突起数量少且短而粗的阿米巴样神经小胶质细胞数量增多，但是与LPS组相比较，阿米巴样神经小胶质细胞的数量明显减少。由此提示，一定浓度的APS对于LPS诱导的BV-2细胞的活化具有明显的抑制作用，见图3。

2.3APS对活化的BV-2细胞生存活性的影响 如图2可以看出，3个LPS刺激浓度都均可以活化神经小胶质细胞，从细胞形态学上可以初步判断，LPS浓度为0.1 μg/ml时，细胞生存活性较高，为了精确验证不同浓度的LPS对BV-2细胞生存活性的影响，我们通过MTT法进行检测，结果显示，在LPS浓度高于0.1 μg/ml时，细胞生存活性明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)。因此，LPS的诱导浓度为0.1 μg/ml更适合本研究，如图4A、表1。

图4 APS提高活化的BV-2细胞的生存活性Fig.4 APS increased viability of active BV-2 cellNote:A.The viability of BV-2 cell after the intervention of LPS in different concentrations by MTT;B.The viability of BV-2 cell after the treatment with APS in different concentrations by MTT.Compared with control group,*.P<0.01；compared with LPS group, # .P<0.01.

表1不同浓度LPS对BV-2细胞生存活性的影响

Tab.1InfluenceofdifferentconcertrationofLPSonviabilityofBV-2cells

Drugconcentration(μg/ml)2hcellviability(%ofcontrol)BV⁃2cell0100 00±0 00580 193 92±0 02421)1 085 85±0 03002)10 083 44±0 04262)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with LPS group,2)P<0.01.

表2LPS刺激BV-2神经小胶质细胞后其分泌的TNF-α、IFN-γ的水平增加

Tab.2LPSinducedlevelofTNF-αandIFN-γincreasedinBV-2cells

GroupsTNF⁃α(pg/ml)IFN⁃γ(pg/ml)Controlgroup218 11±1 95147 75±1 77LPSgroup1028 40±14 681)250 61±2 761)

Note：Compared with control group, 1)P<0.01.

图5 APS对活化的BV-2细胞TNF-α、IFN-γ的分泌水平的影响Fig.5 Influence of APS on expression of TNF-α and IFN-γ in active BV-2 cellsNote:Compared with control group,*.P<0.01；compared with LPS group, #.P<0.01.

通过文献查阅和预实验结果，将APS的作用浓度设置为0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mg/ml。实验分为对照组、LPS组、APS组、实验组(LPS+APS组)，结果显示，在BV-2细胞中加入LPS后，细胞活性明显下降(P<0.01)，与LPS组相比，实验组加入APS后有效提升了BV-2细胞的生存活性(P<0.01)。当APS浓度大于0.8 mg/ml时，实验组与阳性对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明，低浓度的APS可以有效提高LPS诱导活化的BV-2细胞活性，高浓度的APS则不能起到有效地保护作用。结果如图4B所示。

2.4APS对活化的BV-2细胞TNF-α、IFN-γ水平的影响 根据不同浓度的LPS对BV-2细胞生存活性的影响实验，选取LPS的诱导浓度为0.1 μg/ml，干预BV-2神经小胶质细胞24 h后，检测细胞培养上清液中TNF-α、IFN-γ分泌含量，发现经LPS刺激后，LPS组的两种细胞因子分泌水平较对照组明显升高，如表2所示。用5个浓度的APS干预活化后的神经小胶质细胞，如图5所示。结果显示，当APS浓度小于等于0.4 mg/ml时，APS有效地降低了BV-2活化后释放的TNF-α、IFN-γ水平(P<0.01)，当APS浓度大于0.4 mg/ml时，将不能降低TNF-α、IFN-γ含量，而且当APS浓度大于等于1.0 mg/ml时，BV-2细胞上清中TNF-α、IFN-γ含量高于阳性对照组(P<0.01)。单独用APS干预的BV-2细胞上清中，2个细胞因子水平无明显变化。综上可得，低浓度的APS能有效地降低LPS活化的BV-2细胞炎性因子TNF-α、IFN-γ的分泌，对正常的BV-2起到抗炎保护作用。高浓度的APS则不具有这种作用，相反，当其浓度高到一定程度时会增加细胞炎性因子TNF-α、IFN-γ的分泌。

图6 APS对活化的BV-2细胞PD-L1蛋白水平和mRNA水平表达的影响Fig.6 Influence of APS on expression of protein and mRNA of PD-L1 in active BV-2 cellsNote:A.PD-L1 protein expression level in active BV-2 cells treated with APS by Western blot;B.Relative PD-L1 protein level;C.Relative PD-L1 mRNA level by Real-time PCR.Compared with control group,*.P<0.05；compared with LPS group,#.P<0.05.

2.5APS对BV-2神经小胶质细胞的表面共刺激分子PD-L1 mRNA和蛋白表达变化的影响 结果显示，LPS刺激BV-2神经小胶质细胞后，其表面PD-L1蛋白表达及mRNA转录水平略升高，用一定浓度的APS干预后，其表面PD-L1蛋白表达及mRNA转录水平进一步升高，与对照组和LPS组相比，有显著差异。研究结果如图6。

3 讨论

本研究团队在前期工作中观察了中药黄芪对EAE 小鼠的治疗作用，发现，与未治疗的EAE对照组相比较[10]，黄芪治疗组小鼠EAE的发病起始及发病高峰时间均有所延迟，且发病高峰期症状评分明显低于EAE组，表明黄芪对EAE 小鼠的临床症状具有缓解作用，实验证实了中药黄芪对EAE具有肯定的治疗效果。在此基础上，发现黄芪能减轻中枢神经系统的炎性反应，抑制MOG35-55特异性T 细胞增殖及IFN-γ、TNF-α、IL-17的分泌，促进IL-4 的分泌。提示黄芪在EAE 发病过程中的治疗通过抑制Th1 和Th17 细胞、促进Th2 细胞功能而发挥作用。为了进一步揭示黄芪治疗EAE的药理机制[10]，本实验观察了黄芪的有效成分APS对小鼠EAE临床症状的影响，发现其能够明显改善小鼠EAE的临床症状评分，较黄芪改善作用更为明显，提示APS对小鼠EAE具有肯定的治疗作用。

在证实APS对EAE治疗作用的基础上，本研究进一步探索了APS对小鼠EAE发挥治疗作用的分子机制。近几年来，随着众多学者对MS临床和实验研究的不断深入，发现神经小胶质细胞活化后介导的神经炎性反应在MS/EAE的病理过程中扮演重要角色，抑制神经小胶质细胞的过度活化以及抑制炎性因子的产生成为治疗MS的新策略，因此，本研究团队进一步探索了APS对神经小胶质细胞的调控作用，并从PD-1/PD-L1信号通路探究了体外条件下APS对PD-L1蛋白及基因表达的影响。研究发现，一定浓度的APS可以明显抑制LPS诱导的BV-2神经小胶质细胞分泌的细胞因子TNF-α、IFN-γ，抑制神经小胶质细胞的活化，同时诱导PD-L1 mRNA和蛋白表达上调。众所周知，PD-1/PD-L1信号通路为负性调控信号，所以，APS诱导PD-L1表达增加后，可以抑制神经小胶质细胞的活化，从而抑制炎症因子分泌及对髓鞘的损伤。

神经小胶质细胞广泛分布在CNS，占中枢神经系统整个胶质细胞数目的5%～20%，生理状态时，神经小胶质细胞处于静息态，其表面非常多的细胞突起在不断地伸缩从而探索周围的环境[13]，其主要作用是清除死亡的细胞以及轴突碎片，诱导神经元和血管内皮细胞的凋亡，分泌神经营养因子以支持神经元和胶质细胞的正常功能，在神经突起的发育中起引导作用，亦能促进星型胶质细胞的增生，增加髓鞘的形成，刺激中枢神经系统血管形成[14]。当发生感染、损伤或神经元电活动紊乱等病理过程时，静息态的神经小胶质细胞会发生一系列形态、基因表达和功能方面的变化，导致神经小胶质细胞的活化[15]。活化后的神经小胶质细胞在神经系统病理过程中发挥双刃剑的作用，一方面，神经小胶质细胞活化后能够分泌多种炎性介质，如IL-6、IL-23、IL-1β和TNF-α、NO、氧自由基、蛋白水解酶等，对神经元产生毒害作用[16]；另一方面，活化后的神经小胶质细胞能够通过抗兴奋毒、抗氧化酶、释放神经营养因子和抗炎因子及免疫吞噬等作用发挥神经保护作用，促进神经再生[17，18]。

APS为中药黄芪的主要活性成分，是黄芪中重要的天然有效成分，具有多重免疫活性，可体现在因剂量不同，作用不同方面，Zhang等[19]发现低剂量的APS对小鼠的CD40、CD86有轻微抑制作用，而高剂量时则表现促进作用,而大多数研究结果也显示APS的作用效果在适当范围内呈现一定的剂量反应关系[20，21]。本研究的结果也呈现为低浓度APS抑制神经小胶质细胞的活化，高浓度则减轻了对神经小胶质细胞活化的抑制作用，剂量与功效有依存关系。本实验研究证实了APS能够抑制LPS诱导的BV-2神经小胶质细胞的活化，提高活化后的细胞生存率，降低活化后BV-2细胞TNF-α、IFN-γ等炎性因子的分泌，以明确APS对EAE的治疗作用和免疫机制。

PD-1/PD-Ls信号通路主要介导中枢和外周T细胞的免疫耐受和调节自身免疫反应，研究发现，PD-1/PD-L1信号通路在EAE的发病机制中具有明显的调控作用[22]。PD-1/PD-L1作为负性免疫调节信号通路，合理的增强或抑制其信号通路已被广泛用于肿瘤免疫治疗、病毒和微生物感染、器官移植和自身免疫性疾病等实验性治疗，并且取得了良好的疗效，美国已有公司研发出重组人类PD-1、PD-L1 抗体，且已被FDA 批准，主要用于某些肿瘤的治疗[23]。本文发现，APS对BV-2神经小胶质细胞PD-L1的mRNA转录水平和蛋白质翻译水平均具有明显的上调作用，从而激活了PD-1/PD-L1分子信号的负调控作用，抑制了炎性细胞因子 TNF-α、IFN-γ分泌，因此，抑制神经系统的炎性反应，最终治疗中枢神经系统炎症性脱髓鞘疾病。

3 结论

APS对小鼠EAE的临床症状有明显的抑制作用，其发挥作用的机制可能是由于APS上调了神经小胶质细胞PD-L1的基因和蛋白表达，进而抑制了神经小胶质细胞的活化，减少了炎性细胞因子IFN-γ、TNF-α的分泌，这为临床应用APS治疗MS等神经系统退行性疾病提供了新的思路和方法。

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