雷竹PvJ3基因克隆及功能分析

陈晓沛，施 泉，郭小勤，曹友志，徐英武

（浙江农林大学 省部共建亚热带森林培育国家重点实验室，浙江 杭州311300）

开花是高等植物进入生殖生长的标志，是植物完成生活史的必要环节。在拟南芥Arabidopsis thaliana中的研究发现，开花过程受多种内源因素和外源环境因素的影响，由复杂基因网络严格调控［1］。光周期途径中植物开花受季节性昼长变化影响［2］；赤霉素（GA）途径是在非诱导光周期途径的条件下，在开花过程中发挥作用［3］；春化途径中植物开花要受到低温积累的影响［4］；自主途径中通过感知植物自身内部发育状态而调控植物开花［5］，多种途径的成花调节信号最终都集中于2个整合因子：开花促进因子FLOERING LOCUS T（FT）和 SUPPRESSPR OF OVEREXPRESION OF CONSTANS 1（SOC1）［6-8］。 在拟南芥中，过表达FT基因会明显促进SOC1基因的表达量；同时在ft突变体中，SOC1的表达量明显下降［9-11］，但是对ft和soc1双突变体与ft单突变体植株的开花时间进行统计，结果显示没明显差异，可知除FT蛋白调控SOC1的表达外，还存在另外的途径影响SOC1基因的表达［10-13］。其他开花控制因子可以通过FT和SOC1参与开花途径的调控，例如开花抑制因子SHORT VEGETATIVE PHASE（SVP）可以结合SOC1和FT的调控序列，对FT和SOC1产生抑制作用［14］，进而下调它们的表达量。近年，发现拟南芥中属于J蛋白家族一员的J3蛋白，可以与SVP蛋白相互作用调控SOC1和FT基因的表达量，而实现对成花信号的调节，在调控开花途径中发挥着十分重要的作用［15］。 J蛋白（J-domain protein）是广泛存在于动植物中的一个庞大的分子伴侣家族，该类蛋白N末端包含1个约由70个氨基酸构成的保守序列——J结构域而被命名为J蛋白［16-17］。J蛋白的J结构域由4个α-螺旋组成，第2和第3个螺旋之间有一个极为保守的由组氨酸、脯氨酸、天冬氨酸组成的HPD三肽，这是J结构域的重要特征［18］；邻近J结构域的是G/F结构域（富含甘氨酸和苯丙氨酸）；之后是锌指结构域。根据结构域的不同J蛋白可分为4类［19］：Ⅰ类J蛋白包含所有常见的结构；Ⅱ类J蛋白缺少锌指结构；Ⅲ类J蛋白只有J结构域；Ⅳ类J蛋白也被称作J-like蛋白，这类蛋白的J结构域没有HPD模块［20-21］。目前发现拟南芥中共有120个J蛋白，其中Ⅰ类J蛋白8个，Ⅱ类J蛋白16个，Ⅲ类J蛋白92个，Ⅳ类J蛋白4个［22］。在植物中，有关J蛋白的研究主要集中在拟南芥中，现有的结果表明，J蛋白可以参与多种生物学过程，包括叶绿体的发育［23-25］、植物的抗逆性［26-27］、信号转导［28-29］和成花途径［15］等。在拟南芥开花调控中，J3蛋白通过与SVP等其他开花关键因子相互作用而影响植物成花过程，SVP的突变体svp-41表现为早花现象，J3的突变j3-1表现为晚花现象，同时在j3-1和svp-41的双突变体中，拟南芥表现出早花现象，与svp-41的单突变体的表型相似，这一结果表明J3基因通过与SVP的相互作用实现对开花时间的调控［30-31］，进一步研究发现在细胞核中J3基因通过与营养生长短期（SVP）蛋白直接相互作用，衰减SVP蛋白与SOC1和FT调控序列的结合从而上调SOC1和FT基因的表达量［15］。竹类植物开花周期较长并具有时间上的不确定性，而且很多竹子开花后会成片死亡，雷竹Phyllostachys violascens是一种优良的笋用竹种，近年来，雷竹普遍开花，开花后部分雷竹会死亡，导致雷竹笋产量大幅度下降，带来严重的经济损失。有关竹类植物开花的研究已经很多，但是竹子成花机制和花期调控模式至今尚未完全清楚［32］。目前，竹子中还未见有关J3基因生物学功能的研究，本研究以雷竹为研究对象，通过同源克隆技术获得1个J3同源基因，经过亚细胞定位、表达模式和功能分析，以期能为深入研究J3同源基因在竹类植物开花调控机制中的作用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

雷竹材料来源于浙江农林大学智能温室大棚，选取位于同一竹鞭上的笋、花芽、花，开花和不开花雷竹的幼叶、成叶、茎秆，标记分装后放入液氮中速冻，保存在-80℃超低温冰箱。

1.2 核糖核酸（RNA）的提取及互补脱氧核糖核酸（cDNA）的合成

用全 RNA提取试剂盒（鼎国）分别提取采集的雷竹材料的RNA，以提取的RNA（少于0.5 g·L-1）为模板，用Prime ScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）试剂盒（Clontech），反转录获得雷竹各组织的cDNA，检测合格后，于-20℃保存备用。

1.3 目的基因的克隆及序列分析

通过本地Blast，从毛竹Phyllostachys edulis基因组文库中找到一个候选基因序列号（bphylf027h21），根据该候选基因的基因序列设计引物（J3，表1），雷竹cDNA为模板，进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增条带，用胶回收试剂盒（上海生工生物公司）回收纯化电泳条带，将获得的目的片段与pMD19（simple）-T载体置于连接仪上16℃连接1.0～3.0 h，之后转化大肠埃希菌 Escherichia coli DH5α感受态细胞（热转化法），37℃恒温培养箱培养6.0～8.0 h，挑取白色圆形单菌落，菌落PCR鉴定出阳性单克隆，送测序，得到碱基序列。

用Vector NTI预测基因序列的开放阅读框（ORF）区，据此设计引物（PvJ3，表1），重复上述实验过程，最终测序得到雷竹PvJ3基因序列。运用TMHMM和ProtScale分析PvJ3蛋白的结构特征和理化性质；Smart在线分析其蛋白的结构域；通过Clustal X2比对雷竹PvJ3与其他物种中的J3同源基因的氨基酸序列的相似性；并用Mega 5.0构建系统发育树，选择邻近法（NJ），bootstrap回复次数为1 000次。

1.4 组织特异性表达检测

用雷竹各组织部位的cDNA为模板，通过实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR），分析雷竹PvJ3基因的表达模式。根据实验要求设计目的基因的定量引物（PvJ3-1，表1），毛竹的PeNTB基因作为内参基因［33］。各种雷竹组织做3次重复，避光条件下操作，参照SYBR Premix Ex TaqTMII（Takara）试剂盒要求加样。PCR扩增程序（两步法）：预变性95℃，5 min；95℃，30 s；60℃，30 s，循环数为40。反应结束后，分析确定数据的可靠性，选择合适的数据，用2-ΔΔCT方法［34］对数据进行分析。

1.5 亚细胞定位

根据PvJ3基因ORF区序列（不含终止密码子）和pCaM35S-sGFP载体序列上的酶切位点，在目的基因ORF区的上下游分别引入酶切位点SmaI和BamHI，设计引物（PvJ3-2，表1），提取pMD19-PvJ3质粒做为模板，进行PCR反应，胶回收纯化得到带有酶切位点的基因片段与pMD19（simple）-T载体连接转化后，阳性单克隆送测序。将测序正确的单克隆进行扩大培养，用质粒提取试剂盒（上海生工生物公司）提取质粒，用限制性内切酶SmaI和BamHI分别对pMD19-PvJ3和pCaM35S-sGFP载体质粒进行双酶切实验，之后用T4 DNA连接酶在16℃条件下过夜连接胶回收的酶切产物，连接产物转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞，经测序正确，瞬时表达载体PvJ3-GFP构建成功。通过基因枪轰击洋葱Allium cepa表皮，25℃下避光暗培养1～2 d后，用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白信号，金粉的准备和样品的制备参照文献［35］。

1.6 构建转基因过表达载体

根据PvJ3基因ORF区序列和pC1301载体（含有35 S启动子）的序列设计引物（PvJ3-3，表1），在目的基因ORF区的上下游同样分别引入酶切位点SmaI和BamHI，构建过表达载体pC1301-PvJ3，实验方法参照1.5节。

1.7 拟南芥转基因植株检测

通过热转化法将构建成功的pC1301-PvJ3过表达载体转入农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3101感受态细胞中，提取阳性单克隆的质粒，重新转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞，再次测序检验转入重组质粒是否正确。用已正确转入pC1301-PvJ3重组载体的农杆菌配制侵染液，侵染进入花期的野生型拟南芥花序［36］，侵染3次，间隔约1周·次-1，侵染后的拟南芥即T0代植株，将消毒处理后的T0代种子均匀撒在加入潮霉素的1/2 MS（Murashige and Skoog）固体培养基上，潮霉素质量浓度为100.00 mg·L-1，按照V（潮霉素溶液）∶V（1/2MS培养基）=1.50∶1 000.00比例加入培养基中，筛选抗性植株，以采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法［37］提取的抗性植株的基因组 DNA为模板，PCR鉴定出T1代阳性植株，并对植株表型进行初步统计。

表1 本研究所用的引物Table 1 PCR primers used in this study

2 结果与分析

2.1 基因的克隆和序列分析

根据在毛竹转录组数据库中挑选的基因设计引物，利用同源克隆的方法，从雷竹中分离得到1个J3同源基因，命名为PvJ3，分析PvJ3基因的碱基序列，可知，其ORF区由1 260 bp个碱基组成，能编码419个氨基酸。经蛋白结构域和氨基酸序列分析（图1～2），可知PvJ3蛋白的N端有J蛋白家族典型的J结构域，同时具有锌指结构域，C末端有法尼基化信号CAQQ序列。用ClustalX2软件对不同物种的 J3同源蛋白的氨基酸进行序列比对，结果发现：J3蛋白在各类物种中的相似性很高，与拟南芥J3蛋白的一致性可达80.90%（图2）。采用临近法构建系统进化树，结果显示：雷竹J3蛋白与单子叶植物高粱Sorghum bicolor和玉米Zea mays的亲缘关系最近，水稻Oryza sativa，大麦Hordeum vulgare和小麦Triticum aestivum次之，与双子叶拟南芥和亚麻荠Camelina sativa的亲缘关系最远（图3）。

图1 PvJ3蛋白结构示意图Figure 1 Structure diagram of PvJ3

2.2 组织特异性表达分析

通过qRT-PCR技术，对同一竹鞭上开花和不开花雷竹中PvJ3基因在不同组织部位的表达水平进行分析。结果表明：PvJ3基因在同一竹鞭的笋、花芽、花，开花与不开花的茎秆、成叶、幼叶中均有表达。在开花雷竹的茎秆中PvJ3基因的表达量最高，茎、花芽、花、幼叶和成叶中的表达依次降低。在不开花雷竹的茎秆中PvJ3基因的表达量同样也是最高，幼叶、成叶中表达量基本一样（图4）。

2.3 亚细胞定位结果分析

用基因枪轰击洋葱表皮细胞，通过荧光显微镜观察瞬时表达载体PvJ3-GFP绿色荧光蛋白的信号，确定PvJ3蛋白的定位情况（图5）。pCaM35S-GFP对照在整个洋葱细胞里均有荧光信号，而PvJ3-GFP在细胞质核细胞核里有荧光信号，因此推断PvJ3蛋白主要定位在细胞质和细胞核中。

2.4 PvJ3基因在拟南芥中的过量表达分析

构建过表达载体pC1301-PvJ3转化野生型拟南芥收取T0代种子，潮霉素筛选抗性植株，以抗性植株基因组DNA为模板，经PCR检测得到T1代拟南芥共37株。观察统计T1代植株中长势较好的30株转基因植株的表型，发现PvJ3基因的过表达植株开花时间明显早于野生型（图6B）。统计结果显示：转基因植株开花天数比野生型植株显著提早（P＝6.51E-15＜0.01），平均提早3.50 d（图6C），开花时莲座叶数目比野生型植株显著减少（P＝9.24E-09＜0.01），平均减少4.43叶（图6D），且表现出多主茎现象（图6A）。

3 讨论

高等植物成花过程存在多种诱导途径，大量基因参与这些途径的调控，成花关键基因的研究对于开花过程及花发育调控有着重要意义［38］。拟南芥中研究发现，SOC1和FT是感知不同开花途径信号的整合因子，SVP是直接调控 FT和 SOC1的转录调控因子［8,39］，J3蛋白通过与SVP直接相互作用而衰减SVP与SOC1和FT调控序列的结合从而上调SOC1和FT的表达量，参与拟南芥的成花过程，这一发现使得拟南芥成花调控网络更加完善［15］。本研究成功从雷竹中克隆得到J3同源基因并命名为PvJ3，雷竹PvJ3所编码的氨基酸序列与拟南芥J3蛋白氨基酸序列一致性达80.90%，对其蛋白结构域分析可知，PvJ3拥有相对保守的J结构域以及锌指结构域，可以说明PvJ3属于J家族中的一员。

为了研究雷竹PvJ3蛋白的功能，本研究通过qPCR技术和亚细胞定位分析该蛋白在雷竹中的表达模式和表达部位。对雷竹PvJ3基因进行了不同组织部位特异性表达分析，结果显示雷竹PvJ3基因在同一竹鞭的不同组织部位都有表达，已发现双子叶植物拟南芥J3基因同样在根、茎、叶、花芽、花和果荚等不同组织中表达［29］，说明J3基因在单双子叶植物中均表现出全株表达的现象。在相对表达量上，PvJ3基因在开花雷竹茎秆中表达量最高，在花芽和花中的表达量降低，这与已报道的拟南芥中J3基因在花中表达量最高［15］的结果存在差异。PvJ3蛋白亚细胞定位结果显示该蛋白定位在细胞质和细胞核，与拟南芥中J3蛋白的亚细胞定位结果相一致［15］，拟南芥中和J3蛋白具有互作关系的SVP，SOC1和FT蛋白都是核蛋白，说明雷竹PvJ3可能在细胞核中与这些开花整合因子相互作用，从而对开花途径进行调控。

图2 PvJ3与其同源基因的氨基酸序列比对Figure 2 Alignment of the PvJ3 amino acid sequences from different plant species

将PvJ3基因导入野生型拟南芥植株验证其功能，T1代转基因植株的表型统计结果表明：转基因拟南芥植株开花时间明显早于野生型植株，开花时莲座叶数量明显减少（图6 C，图6D），而拟南芥J3基因的过表达植株和野生型植株的开花时间并没有明显差别［15］，这说明雷竹PvJ3基因可以显著影响花期，可能是一个开花促进因子。值得注意的是，转雷竹PvJ3基因拟南芥植株同时表现出多主茎现象（图6A），这一现象在拟南芥J3过表达植株中并没有被观测到［15］。 以上结果表明， 雷竹PvJ3基因不仅在成花调控中的功能和拟南芥J3基因存在一定差异，同时还可能参与茎的发育等其他生长发育过程，在基因功能上比拟南芥同源基因要复杂的多。

图3 不同物种J3蛋白的系统进化树分析Figure 3 Phylogenetic tree analysis of J3 in different plant species

目前，J3基因功能的有关研究主要以模式植物拟南芥为研究对象，单子叶植物中还未见报道。通过对比J3基因在雷竹和拟南芥中的表达模式不难发现：雷竹PvJ3基因和拟南芥J3基因都是全株表达，同时编码蛋白都定位在细胞质和细胞核，这表明J3基因在不同植物中的表达部位不存在明显差异，并且可能是一个核内作用蛋白。在相对表达量上，雷竹PvJ3基因和拟南芥J3基因存在一定差异，同一竹鞭上开花和不开花雷竹中PvJ3基因在茎秆中表达量最高，而拟南芥中J3基因表达量在花中最高，这可能与雷竹PvJ3基因参与茎的发育有关。转基因实验的结果表明：雷竹PvJ3基因不仅可以显著提早拟南芥开花时间，同时还促使拟南芥出现多主茎现象，这表明雷竹PvJ3基因很可能参与除了开花调节以外的其他生长发育过程的调控。由于拟南芥和竹子之间的差异很大，雷竹PvJ3基因在竹子中是否可以促进植物提早开花，同时还参与哪些生物学过程，需要后续研究进一步验证。

图4 PvJ3在开花雷竹与不开花雷竹的不同部位表达水平Figure 4 Expression of PvJ3 in different tissues of Phyllostachys violascens

图5 PvJ3蛋白亚细胞定位结果Figure 5 Subcellular localization of PvJ3 fusion protein

图6 PvJ3过表达拟南芥T1植株表型Figure 6 Phenotypes of the PvJ3 transgenic Arabidopsis thaliana in T1generation

［1］ QUESADA V,DEAN C,SIMPSON G G,et al.Regulated RNA processing in the control of Arabidopsis flowering ［J］.Int J Dev Biol,2005,49（5/6）：773-780.

［2］ SIMPSON G G,DEAN C.Arabidopsis,the Rosetta stone of flowering time? ［J］.Science,2002,296（5566）：285-289.

［3］ LIU Chang,CHEN Hongyan,HONG Linger,et al.Direct interaction of AGL24 and SOC1 integrates flowering signals in Arabidopsis ［J］.Development,2008,135（8）：1481-1491.

［4］ DENNIS E S,PEACOCK W J.Epigenetic regulation of flowering ［J］.Curr Opin Plant Biol,2007,10（5）：520-527.

［5］ BOSS P K,BASTOW R M,MYLNE J S,et al.Multiple pathways in the decision to flower：enabling,promoting,and resetting ［J］.Plant Cell,2004,16（suppl）：S18-S31.

［6］ WANG Cunxi,TIAN Qing,HOU Zhenglin,et al.The Arabidopsis thaliana AT PRP39-1 gene,encoding a tetratricopeptide repeat protein with similarity to the yeast pre mRNA processing protein PRP39,affects flowering time ［J］.Plant Cell Rep,2007,26（8）：1357-1366.

［7］ MOURADOV A,CREMER F,COUPLAND G.Control of flowering time interacting pathways as a basis for diversity［J］.Plant Cell,2002,14（suppl）：S111-S130.

［8］ PENG Zhenhua,LU Ying,LI Lubin,et al.The draft genome of the fast-growing non-timber forest species moso bamboo （Phyllostachys heterocycla） ［J］.Nat Gen,2013,45（4）：456-461.

［9］ TORTI S,FORNARA F.AGL24 acts in concert with SOC1 and FUL during Arabidopsis floral transition ［J］.Plant Sign Behav,2012,7（10）：1251-1254.

［10］ NAVARRO C,CRUZ-ORÓ E,PRAT S.Conserved function of FLOWERING LOCUS T （FT） homologues as signals for storage organ differentiation ［J］.Curr Opin Plant Biol,2015,23（1）：45-53.

［11］ YAMASHINO T,YAMAWAKI S,HAGUI E,et al.Clock-controlled and FLOWERING LOCUS T （FT）-dependent photoperiodic pathway in Lotus japonicus I：verification of the flowering-associated function of an FT homolog ［J］.Biosci Biotechnol Biochem,2010,77（4）：747-753.

［12］ NAKANO Y,HIGUCHI Y,YOSHIDA Y,et al.Environmental responses of the FT/TFL1 gene family and their involvement in flower induction in Fragaria × ananassa ［J］.J Plant Physiol,2015,177（24）：60-66.

［13］ LEE J,LEE I.Regulation and function of SOC1,a flowering pathway integrator ［J］.J Exp Bot,2010,61（9）：2247-2254.

［14］ LEE J H,YOO S J,PARK S H,et al.Role of SVP in the control of flowering time by ambient temperature in Arabidopsis ［J］.Genes Dev,2007,21（4）：397-402.

［15］ SHEN Lisha,KANG Y G G,LIU Lu,et al.The J-domain protein J3 mediates the integration of flowering signals in Arabidopsis ［J］.Plant Cell,2011,23（2）：499-514.

［16］ RAJAN V,D’SILVA P.Arabidopsis thaliana J-class heat shock proteins：cellular stress sensors ［J］.Funct Int Genom,2009,9（4）：433-446.

［17］ MIERNYK J A.The J-domain proteins of Arabidopsis thaliana：an unexpectedly large and diverse family of chaperones ［J］.Cell Stress Chap,2001,6（3）：209-218.

［18］ QIAN Yanqiu,PATEL D,HARTL F U,et al.Nucleic magnetic resonance solution structure of the human Hsp40（HDJ-1） J-domain ［J］.J Mol Biol,1996,260（2）：224-235.

［19］ CRAIG E A,HUANG P,ARON R,et al.The diverse roles of J-proteins,the obligate Hsp70 co-chaperone ［J］.Rev Physiol Biochem Pharmacol,2006,156（1）：1-21.

［20］ MARTINEZ-YAMOUT M,LEGGE G B,ZHANG Ouwen,et al.Solution structure of the cysteine-rich domain of the Escherichia coli chaperone protein DnaJ ［J］.J Mol Biol,2000,300（4）：805-818.

［21］ MIERNYK J A.The J-domain proteins of Arabidopsis thaliana：an unexpectedly large and diverse family of chaperones ［J］.Cell Stress Chap,2001,6（3）：209-218.

［22］ SALAS-MUÑOZ S,RODRÍGUEZ-HERNÁNDEZ A A,ORTEGA-AMARO M A,et al.Arabidopsis AtDjA3 null mutant shows increased sensitivity to Abscisic acid,salt,and osmotic stress in germination and post-germination stages［J］.Plant Sci,2016,7（2）：220.doi：10.3389/fpls.2016.00220.

［23］ VITHA S,FROEHLICH J E,KOKSHAROVA O,et al.ARC6 is a J-domain plastid division protein and an evolu-tionary descendant of the cyanobacterial cell division protein Ftn2 ［J］.Plant Cell,2003,15（8）：1918-1933.

［24］ CHEN Kunming,HOLMSTROM M,RAKSAJIT W,et al.Small chloroplast-targeted DnaJ proteins are involved in optimization of photosynthetic reactions in Arabidopsis thaliana ［J］.BMC Plant Biol,2010,10（1）：43.doi：10.1186/1471-2229-10-43.

［25］ SHIMADA H,MOCHIZUKI M,OGURA K,et al.Arabidopsis cotyledon-specific chloroplast biogenesis factor CYO1 is a protein disulfide isomerase ［J］.Plant Cell,2007,19（10）：3157-3169.

［26］ SEKI M,NARUSAKA M,ABE H,et al.Monitoring the expression pattern of 1300 Arabidopsis genes under drought and cold stresses by using a full-length cDNA microarray ［J］.Plant Cell,2001,13（1）：61-72.

［27］ CHAI Tuanyao,ZHANG Yuxiu,ZHAO Wenming.Cloning of cDNA and expression analysis of DnaJ-like gene under heavy metal stress in bean ［J］.Progr Nat Sci,2000,10（2）：135-140.

［28］ SEDBROOK J C,CHEN Rujin,MASSON P H.ARG1 （altered response to gravity） encodes a DnaJ-like protein that potentially interacts with the cytoskeleton ［J］.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96（3）：1140-1145.

［29］ GUAN Changhui,ROAEN E S,BOONSIRICHAI K,et al.The ARG1-LIKE2 gene of Arabidopsis functions in a gravity signal transduction pathway that is genetically distinct from the PGM pathway ［J］.Plant Physiol,2003,133（1）：100-112.

［30］ THEIβEN G,KIM J T,SAEDLER H.Classification and phylogeny of the MADS-box multigene family suggest defined roles of MADS-box gene subfamilies in the morphological evolution of eukaryotes ［J］.J Mol Evol,1996,43（5）：484-516.

［31］ WIGGE P A,KIM M C,JAEGER K E,et al.Integration of spatial and temporal information during floral induction in Arabidopsis ［J］.Science,2005,309（5737）：1056-1059.

［32］ de CARVALHO A L,NELSON B W,BIANCHINI M C,et al.Bamboo-dominated forests of the southwest Amazon：detection,spatial extent,life cycle length and flowering waves ［J］.PLoS One,2013,8（1）：e54852.doi：10.1371/journal.pone/0054852.

［33］ 齐飞艳，胡陶，彭镇华，等.毛竹实时荧光定量PCR内参基因的筛选及成花基因PheTFL1表达分析［J］.西北植物学报， 2013， 33（1）： 48-52.QI Feiyan,HU Tao,PENG Zhenhua,et al.Screening of reference genes used in qRT-PCR and expression analysis of PheTFL1 gene in moso bambo ［J］.Acta Bot Boreal-Occident Sin,2013,33（1）：48-52.

［34］ LIVAK K J,SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmd ［J］.Methods,2001,25（4）：402-408.

［35］ 王小利，吴佳海，刘晓霞，等.高羊茅春化基因FaVRN1亚细胞定位与差异表达分析［J］.基因组学与应用生物学， 2011， 30（2）： 152-158.WANG Xiaoli,WU Jiahai,LIU Xiaoxia,et al.Subcellular localization and differential expression analysis of vernalizational gene FaVRN1 in tall fescue ［J］.Genomics Appl Biol,2011,30（2）：152-158.

［36］ CLOUGH S J,BENT A F.Floral dip：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana ［J］.Plant J Cell Mol Biol,1998,16（6）：735-743.

［37］ 高志民，范少辉，高健，等.基于CTAB法提取毛竹基因组DNA的探讨［J］.林业科学研究，2006，19（6）：725-728.GAO Zhimin,FAN Shaohui,GAO Jian,et al.Extract genomic DNA form Phyllostachys edulis by CTAB-based method ［J］.For Res,2006,19（6）：725-728.

［38］ 张素芝，左建儒.拟南芥开花时间调控的研究进展［J］.生物化学与生物物理进展，2006，33（4）：301-309.ZHANG Suzhi,ZUO Jianru.Advance in the flowering time control of Arabidopsis ［J］.Prog Biochem Biophys,2006,33（4）：301-309.

［39］ LI Dan,LIU Chang,SHEN Lisha,et al.A repressor complex governs the integration of flowering signals in Arabidopsis ［J］.Dev Cell,2008,15（1）：110-120.