塞来昔布对创伤性异位骨化模型大鼠的BMP—4影响

柳明忠　曾荣东　张志珊　郑锦阳

[摘要]目的为探究塞来昔布对创伤性异位骨化大鼠模型的BMP-4的影响。方法该研究于2016年5月-2017年4月给予该院建立的创伤性异位骨化模型大鼠予喂食塞来昔布，分别采取喂食2周、6周、10周的不同方案，通过实时定量PCR及western blot实验，检测模型大鼠跟腱组织BMP-4的表达含量。结果塞来昔布处理后大鼠，实时定量PCR及western blot显示：相比于生理盐水处理大鼠，塞来昔布处理大鼠跟腱组织BMP-4的表达明显下调，并且随着塞来昔布处理时间的延长，BMP-4的表达也相应的下调。结论塞来昔布可通过降低大鼠跟腱组织BMP-4的表达以干预异位骨化

[关键词]塞来昔布；异位骨化；BMP-4

[中图分类号]R285 [文献标识码]A [文章编号]1674-0742（2017）10（a）-0018-04

临床上将骨组织以外发生的骨化称为异位骨化（Heterotopic ossification，HO），其本质是一种以局部纤维组织增生、钙化、化生及伴有异位新骨形成为主要病理特征的非肿瘤反应性病变。主要发病人群为肘关节、髋关节外伤患者，发生后会导致患者出现关节强直、僵硬等症状，关节活动度明显受限，对患者生活和工作造成影响。因此，如何防治异位骨化，已经成为广大相关骨科工作者的重要课题。骨形态发生蛋白（bone nor.phogenetio protein，BMP）是诱导异位骨化的主要活性介质。主要参与骨骼的生长、发育及创伤的修复，其作用的靶细胞是未分化的、有活性的间充质细胞，对肌肉、血管周围间充质细胞具有诱导作用，并能够对软骨细胞和骨细胞进行不可逆性的分化。1965年Urist等发现脱钙的骨基质可以诱导异位骨化的形成，林霖等直接注射BMP-4重组腺病毒在裸鼠肌肉内成功诱导出异位骨化，提示BMP-4与异位骨化的发生关系密切。结合非甾体抗炎药在异位骨化治疗中扮演的重要角色，以及前期研究发现BMP-4在异位骨化进展中所起的重要作用，该研究于2016年5月-2017年4月给予该院建立的创伤性异位骨化模型大鼠予喂食塞来昔布来治疗，分别采取喂食2、6、10周的不同方案，治疗后观察各组大鼠肢体的皮温、肿胀程度及X线表现，并测定模型大鼠跟腱组织BMP-4的表达及其含量。从而为COX-2选择性抑制剂临床预防HO及使用疗程提供实验基础。

1材料与方法

1.1实验动物

实验动物：选取48只健康雄性wistar大鼠，体重均位于220～240g之间。所有大鼠均购买于山东大学动物实验中心。

1.2主要试剂

美国Gibco公司生产的塞来昔布、美国santa公司生产的多克隆抗体、碧云天公司生产的蛋白酶抑制剂。

1.3实验动物模型制备

将48只sD级体重（100+10）g大鼠，雌雄各半，随机分为6组，每组各10只。右侧为实验组。各组大鼠均建立创伤性异位骨化模型，造模方法：给予大鼠腹腔注射2%氯胺酮进行麻醉，剂量为80～100mg/kg。麻醉成功后，将大鼠固定在手术台上，对手术区域皮肤进行脱毛，并使用碘伏进行常规消毒，无菌手术刀片沿大鼠右跟腱纵行切开1cm皮肤切口，显露跟腱止点，垂直切口方向横行切断近止点部跟腱，术后全层缝合切口。

1.4大鼠创伤性异位骨化模型的治疗

术后第1天开始给药，第1、3、5组大鼠均予塞来昔布10mg/（kg·d）喂食，第1组喂食2周，第3组喂食6周，第5组喂食10周，第2、4、6组分别喂食2mL生理盐水2周、6周或10周。各組均灌胃1次，d，术后第1周隔天观察1次，1周后每周观察1次。

1.5大鼠创伤性异位骨化模型效果评价

对比各组大鼠术后10周的皮温、肿胀程度，于麻醉状态下拍摄各组大鼠右肢侧位X线片，观察各组大鼠是否有新骨形成。其中鉴于未有指南明确表明，以上指标的评判标准。②该研究拟：皮温取所有实验动物的皮温平均值。肿胀程度：评分范围0～3分，O分为无肿胀，1分为肿胀位于损伤点，2分为肿胀位于膝关节，3分为肿胀位于膝关节以上。新骨形成情况：评分范围0～1分，0分为无新骨形成，1分为有新骨形成。③检测各组大鼠术后10周跟腱组织中骨形态发生蛋白-4（BMP-4）的含量。

1.6骨形态发生蛋白-4（BMP-4）含量检测

分别进行实时定量PCR检测和western blot检测。（1）实时定量PCR检测：研究标本为大鼠跟腱组织，采集大鼠跟腱组织后，加入适量trizo，在零下20%的环境中孵育15min，以1200r/min的速度离心10min，在跟腱组织标本液中加入75%乙醇进行沉淀，使用DEPC水将沉淀物质溶解，放置于零下70%的冰箱中。之后进行总RNA反转录提取和荧光定量PCR反应，反应条件：①温度95%、预变性、时间10min；②温度95%、变性、时间15s；③温度60%、退火、时间30s；④温度72%、延伸、时间30s，共进行40个循环；⑤72℃末次延伸时间为5min。（2）western blot：收集大鼠跟腱组织，提取蛋白，测定浓度（BCA法），然后取等量蛋白上样电泳，转膜，封闭，加入抗大鼠BNP-4，在4℃条件下孵育过夜，孵育1h后加入二抗山羊抗小鼠IgG，经ECL化学发光显色，内参为GAPDH。最后应用iomad western分析仪自动分析测定蛋白表达量。

1.7统计方法

统计分析软件Graph Pad 6.0。不同组别间采用t检验分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

塞来昔布可通过降低大鼠跟腱组织BMP-4的表达以干预异位骨化。

进一步为探究塞来昔布可明显干预大鼠异位性骨化的具体机制，检测了塞来昔布及生理盐水处理大鼠异位骨化模型中跟腱组织中，与异位骨化显著相关分子BMP-4的表达。在mRNA水平上，通过实时定量PCR检测发现：相比于生理盐水处理大鼠，塞来昔布处理大鼠跟腱组织BMP-4的表达明显下调.并且随着塞来昔布处理时间的延长，BMP-4的表达也相应的下调。为进一步确认BMP-4在塞来昔布影响异位骨化中的作用，我们采用western blot实验，从蛋白角度出发，结果同样显示：比于生理盐水处理大鼠，塞来昔布处理大鼠跟腱组织BMP-4的表达明显下调，并且随着塞来昔布处理时间的延长，BMP-4的表达也相应的下调。由上述内容可知，塞来昔布会导致大鼠跟腱组织中的BMP-4的表达含量减少，影响异位骨化的形成。