基于Lake模型的Pb胁迫对木荷和栾树幼树叶片叶绿素荧光参数的影响研究

黄鑫浩,朱 凡,胡丰姣,梁惠子,王仁杰,邹志刚

1 中南林业科技大学生命科学与技术学院, 长沙 410004 2 南方林业生态应用技术国家工程实验室, 长沙 410004

铅(Pb)是土壤中常见的有毒重金属,Pb对土地的污染已成为全球一大环境问题。调查显示,我国土壤重金属污染超标率为16.1%,其中Pb的点位超标率达1.5%。值得注意的是,在我国林地中(天然林、次生林和人工林林地)土壤重金属点位也超标[1]。根据研究结果显示[2- 4],相当一部分林地土壤中Pb污染程度偏高。受Pb污染的林地土壤会直接危害到植物生长的环境如土壤微生物、土壤酶活性[5- 6]等。林地里的成年植物吸收大量的Pb会抑制其光合作用、呼吸作用[7- 8],对叶绿体、线粒体都有一定程度的破坏[9]。幼苗受到Pb胁迫后会极大地限制幼苗的生长并在之后的生长期里产生难以消除的影响,最终导致植物生物量、固碳能力下降[10]。因此,从生理角度诊断Pb胁迫下木本植物幼龄阶段的光合作用能力,为筛选出抗性品种对Pb污染的土壤进行植被群落恢复具有重要意义。

不少研究者发现Pb胁迫引起植物光能利用率下降的主要原因有,Pb限制了光合反应中心的电子传递,或由气孔和非气孔限制造成的胞间CO2浓度升高等一系列光合生化过程导致的植物光能利用率的下降[11- 12]。叶绿素荧光动力学参数包含着光合作用过程的重要信息,如光能的吸收和转化、能量的传递与分配、反应中心的活性、过剩能量的耗散以及光合作用的光抑制和光破坏状态等,被广泛用于各种逆境条件下植物光系统运转的无损检测[13- 15]。由于光合单元由多个嵌入在天线色素系统中的反应中心组成,且天线色素系统向每个光系统II(PSII)提供电子[14],因此,Kramer等[16]在Stern-Volmer方法的基础上,引入一个更容易监测稳定性高的参数—光化学猝灭(qL),由此推导出衡量非光化学猝灭过程的两个参数YNPQ和YNO,从而形成Lake模型,即YII+YNPQ+YNO=1。其中YII代表额定光强下PSII的量子效率,YNPQ代表可调节性的能量耗散,YNO代表不可调节的非光化学猝灭途径的能量耗散,反映光保护能力,因此Lake模型可以很好的评价PSII反应中心的开放程度和天线色素下游调控引起的光化学效率的变化。

关于叶绿素荧光参数对Pb胁迫的响应,在农作物、草本、木本植物上已经有了充分的研究报道[11,17- 19],但都采用Puddle模型的叶绿素荧光参数进行分析。由于Lake模型中的叶绿素荧光参数在描述额定光强下光系统中能量平衡和分配状况以及植物应对过高激发能量的能力上更具优势,并且,Lake模型独立计算出的PSII量子效率(YII)与基于Puddle模型计算得出的PSII实际光化学效率(YPSII)是一致的[20]。因此,有研究将Lake模型运用于农作物耐旱性[20]、光驯化[21]和光抑制[22]的研究中,那么能否将Lake模型用于快速评价重金属Pb胁迫下木本植物光系统功能的正常运转呢？基于Lake计算出的叶绿素荧光参数在Pb胁迫下的木本植物中又有怎样的变化特征？为此,本论文以我国南方常见的常绿阔叶树木荷(Schimasuperba)和落叶阔叶树栾树(Koelreuteriapaniculata)1年生幼树为目标树种,其中,栾树对铅有一定耐性[23- 24]、木荷对铅耐性不强[25- 26],两者都为阳性树种,喜光,适宜在亚热带地区生长。试验采用盆栽试验方法,人工配制土壤Pb污染的3个浓度梯度水平(L1

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试苗木

1.1.2 供试土壤

均采自于中南林业科技大学校园内10—20cm表层土,土壤pH值为5.17,土壤全C、全N、全P和Pb含量分别为12.13、0.24、0.16、0.02g/kg。

1.1.3 试剂

采用纯度为99%的PbCl2分析纯试剂。

1.1.4 试验地

中南林业科技大学西园温室。

1.2 方法

1.2.1 苗木栽植

取回来的土壤经自然风干后,过5mm×5mm筛,去除石头等杂物,装入塑料花盆(上口径30cm、下口径23cm、高26cm),每盆中风干土重9kg,待用；将试验苗木移载到盆中,每盆1株。

将不同车速下各个位置空气弹簧内压的最大值与最小值列于表2，并计算出每种工况下空气弹簧内压的最大波动。由表2中的计算结果可知，交会车速越高，空气弹簧的内压波动越大，当两列动车组以450 km/h的车速交会时，空气弹簧的内压波动可以达到30.73%。而空气弹簧的内部压力会直接影响空气弹簧的动态特性[5-6]，因此需要基于空气弹簧的气动响应深入分析动车组在交会时的整车动力学特性，并对其运行安全性进行评判。

1.2.2 土壤处理

待苗木生长稳定后(约2个月),进行Pb污染处理,将PbCl2分析纯试剂折合成每盆土中所需PbCl2的量,设置3个浓度梯度(以纯金属质量计算)[27- 29],以不加重金属为对照(CK),见表1,将PbCl2配成水溶液,按比例一次性均匀喷施到盆栽土壤中(未喷洒到植物表面且没有渗出液)。每个Pb处理浓度选择植株长势均匀一致的3盆作为重复,对照为3盆,共24盆。

1.2.3 盆栽管理

苗木移栽后,将所有盆栽搬进温室内,每隔2—3d用等量(400mL)纯水进行浇灌,避免水从盆底渗出,浇灌时以植物为中心,缓慢均匀的浇灌。温室内白天/夜晚温度为28℃/20℃,湿度为60%—70%,定期对所有盆栽进行锄草,松土等管理措施。

表1 试验土壤Pb浓度水平/(mg/kg)

L1：土壤中Pb浓度为500mg/kg,Soil Pb concentration of 500mg/kg；L2：土壤中Pb浓度为600mg/kg,Soil Pb concentration of 600mg/kg；L3：土壤中Pb浓度为900mg/kg,Soil Pb concentration of 900mg/kg

1.3 叶绿素荧光参数和最大净光合参数的测定

采用便携式脉冲调制叶绿素荧光仪(Mini-PAM,德国 WALZ)。测定时间为Pb污染处理后的第15天,每种树在3个Pb处理组和对照组(CK)各选取3盆盆栽,每盆选取长势相同且完全展开叶3片,进行荧光诱导动力学参数测量,测定时间为7:30—11:30。测定方法为：先将叶片暗适应20min,获得F0(初始荧光)和Fm(最大荧光)。利用Mini-PAM测定样品的快速光响应曲线时,设置光化光强度为1、光化光持续时间为40s、光合有效辐射(PAR)强度分别为0、105、237、349、553、796、1129μmol m-2s-1,得到Fs(稳态荧光)和Fm′(稳态最大荧光)。基于Lake模型的叶绿素荧光参数,可以根据Kramer[16]等计算公式得出: PSII量子效率YII=(Fm′-Fs)/Fm′；光化学猝灭qL=(Fo′/Fs)(Fm′-Fs)/(Fm′-Fo′)；非调节性能量耗散YNO=1/(NPQ+1+qL(Fm/Fo-1)),其中NPQ=Fm/Fm′-1；可调节性能量耗散YNPQ=1-YII-YNO；相对电子传递速率rETR=PAR×0.84×0.5×YII,其中,0.84为经验性吸光系数,0.5为假设天线色素吸收的光能被两个光系统平均分配[30]；最大光化学效率Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm。

植物最大净光合速率(Pn)的测定采用Li- 6400(Licor,USA)光合仪的2cm×3cm标准叶室进行。测定时间为Pb污染处理后的第15天,每种树在3个Pb处理组和对照组各选取3盆盆栽,每盆选取长势相同的完全展开叶3片,测量时间为9:00—11:00。人工设定光强为1000μmol m-2s-1,叶室空气温度测定控制在25—30℃,叶室空气湿度控制在40%—60%。

1.4 数据处理与分析

使用Excel 2013和Origin 8进行数据处理,所有结果为3次重复数据的均值,利用SPSS 20.0对不同Pb2+浓度及不同树种之间植物叶片叶绿素荧光参数进行单因素方差方析,并采用Duncan进行多重比较分析,显著性水平为P<0.05。图表制作由Sigmaplot12.5软件完成。

2 结果与分析

2.1 Pb胁迫下叶片rETR、YII的光响应

如图1所示,两种供试植物叶片相对电子传递速率(rETR)在对照组和Pb处理组均随着PAR的升高而升高,但上升幅度随着Pb2+胁迫程度的增加而减小。3个不同Pb处理浓度下的rETR在不同光强下,两种供试植物的rETR均表现为Pb处理<对照。对于栾树,当PAR小于349μmol m-2s-1时,L1和L2两个浓度间的rETR无显著差异(P>0.05)；当PAR大于349μmol m-2s-1时,L2显著低于L1(P<0.05)；在L3浓度下,栾树叶片的rETR在任意PAR下均显著低于前两个处理浓度(P<0.05),且在553μmol m-2s-1的光强下出现峰值。而对于木荷,当PAR大于105μmol m-2s-1时,L2浓度下的rETR显著低于L1(P<0.05)；在L3浓度下,木荷叶片的rETR出现了大幅度的下降,与前两个浓度相比,差异性显著(P<0.05)；L1和L2两个浓度间的rETR在796μmol m-2s-1的光强下出现峰值,而在L3处理浓度下,rETR的峰值出现在光强为553μmol m-2s-1时。说明Pb胁迫会抑制植物叶片相对电子传递速率,并随着Pb胁迫浓度的增加,光抑制现象会随PAR的升高提早出现。

图1 Pb胁迫对栾树、木荷叶片rETR的影响Fig.1 Response of rETR in the leaves of K. paniculata, S. superba Gardn. to Pb2+stressL1：土壤中Pb浓度为500mg/kg,Soil Pb concentration of 500mg/kg；L2：土壤中Pb浓度为600mg/kg,Soil Pb concentration of 600mg/kg;L3：土壤中Pb浓度为900mg/kg,Soil Pb concentration of 900mg/kg

由图2可以看出,两个供试植物叶片YII,无论是在对照和还是Pb处理下,都随着光强的增加而降低。不同Pb处理浓度后的YII与对照相比,在各个光强下均表现为Pb处理<对照,且差异性显著(P<0.05)。栾树在L1和L2两个浓度,YII下降的差异性不显著(P>0.05),而在L3处理后,显著低于前两个处理浓度(P<0.05)。木荷在3个不同浓度的Pb处理后,与对照相比,YII下降幅度表现为：L3>L2>L1,且差异性显著(P<0.05)。通过方差分析两种供试植物在不同处理下的YII,我们得出,在L1浓度时,栾树的YII低于木荷且差异性显著(P=0.048)；在L2浓度下,二者大小相当；而在L3浓度则相反,说明在低浓度Pb胁迫下,木荷的光反应中心的非环式电子传递效率高于栾树,随着Pb胁迫程度的加大,相对于木荷,栾树还能保持较高的非环式电子传递效率。

图2 Pb胁迫对栾树、木荷叶片YII的影响Fig.2 Response of YII in the leaves of K. paniculata, S. superba Gardn to Pb2+stress

2.2 Pb胁迫下叶片qL、YNPQ、YNO的光响应

图3所示,两个供试植物叶片qL,无论是在对照和还是Pb处理下,都随着光强的增加而降低。不同Pb处理浓度后的qL与对照相比,在各个光强下均表现为Pb处理<对照；在3个浓度的Pb处理后,与对照相比,栾树的qL下降幅度表现为：L1和L2处理后下降幅度相当,L3处理后降幅大于L1和L2两个浓度,且差异性显著(P<0.05)；木荷则表现为：L1处理后下降幅度不大,L3处理后的下降幅度大于L2处理,且差异性显著(P<0.05)。方差分析表明,在L1处理下,木荷稍高于栾树；在L2和L3处理下,则表现为栾树>木荷,且差异性显著(在L2和L3梯度下,P值分别为0.044和0.009)。这说明木荷在低浓度Pb胁迫下,PSII反应中心的开放程度能保持在较高水准,随着处理浓度的增大,其光能转化能力弱于栾树。

图3 Pb胁迫对栾树、木荷叶片qL的影响Fig.3 Response of qL in the leaves of K. paniculata, S. superba Gardn to Pb2+stress

图4所示,两个供试植物叶片的YNPQ无论是在对照和还是Pb处理下,都随着光强的升高而增加。在3个不同Pb浓度下,栾树YNPQ均表现为Pb处理>对照,且差异性显著(P<0.05)；当PAR大于349μmol m-2s-1时,栾树叶片的YNPQ随Pb浓度的增大而增加。木荷叶片的YNPQ在L1浓度处理后,与对照相比变化不大,L2处理后较对照略有升高,L3处理后出现较大幅度上升,且显著高于对照(P<0.05)。通过方差分析得出：在L1和L2处理下,栾树的YNPQ显著高于木荷(P值分别为0.047、0.034),虽然木荷在L3处理下YNPQ大幅度升高,但其值仍显著低于栾树(P=0.031),这说明栾树对Pb胁迫的反应速率和通过自身调节能量耗散的能力均高于木荷。

图4 Pb胁迫对栾树、木荷叶片YNPQ的影响 Fig.4 Response of YNPQ in the leaves of K. paniculata, S. superba Gardn to Pb2+stress

图5所示,不同浓度的Pb胁迫下两种植物的非调节性能量耗散(YNO)随光强的增加无明显变化,但同一光强作用下,各处理间存在差异,均表现为Pb处理>对照,栾树在L1和L2处理后的YNO略高于对照,在L3处理后,显著高于对照(P<0.05)；木荷的YNO上升幅度则表现为：L3>L2>L1,均存在显著性(P<0.05)。通过方差分析得出：在每一个处理浓度下,木荷的YNO均显著高于栾树(P值分别为：0.009、0.004、0.006),说明木荷要通过非调节性能量耗散来消耗更多能量,其可调节性能量耗散的能力低于栾树,同时也说明木荷的光保护能力低于栾树。

图5 Pb胁迫对栾树、木荷叶片YNO的影响Fig.5 Response of YNO in the leaves of K. paniculata, S. superba Gardn to Pb2+stress

2.3 Pb胁迫下叶片Fv/Fm和Pn的响应

最大光化学效率Fv/Fm可反映PSII反应中心捕获激发能的效率与利用能力。如表2所示,在Pb处理后,两种供试植物的Fv/Fm均低于对照,且随着处理浓度的增加呈下降趋势。其中,栾树的Fv/Fm在L3处理后下降显著低于对照；木荷在不同Pb处理后,下降幅度表现为：L3>L2>L1,均显著低于对照(P<0.05),且降幅均高于栾树。通过方差分析可以得出：在不同的处理浓度下,栾树的Fv/Fm均显著高于木荷(P值分别为：0.042、0.027、0.008),说明随着Pb处理浓度的加大,对树种PSII反应中心的损伤越大,同时也说明了栾树较木荷而言在Pb处理下能维持较强的光化学活性。

对两种供试植物最大净光合速率(Pn)的研究中看出(表2),两种供试植物的Pn在Pb处理后,均显著低于对照(P<0.05),且随着处理浓度的增加均呈下降趋势。通过方差分析可以得出：在L1处理下,二者的Pn没有差异性(P=0.175),但在L2、L3处理下,均表现为栾树>木荷,且差异性显著(P值分别0.032、0.005)。

表2Pb胁迫对栾树、木荷叶片最大光能利用率(Fv/Fm)、最大净光合速率(Pn)的影响

Table2Responseofthemaximumquantumuseefficiency(Fv/Fm)、themaximumnetphotosyntheticrate(Pn)intheleavesofK.paniculata,S.superbaGardntoPb2+stress

试验设置TestsetFv/FmThemaximumquantumuseefficiency栾树K．paniculata木荷S．superbaGardn试验设置TestsetPnThemaximumnetphotosyntheticrate栾树K．paniculata木荷S．superbaGardnCK0．81±0．076Aa0．78±0．058AaCK7．51±0．091Aa8．12±0．134AaL10．73±0．057Aa0．63±0．107BbL15．92±0．124Ab5．78±0．125AbL20．65±0．084Aa0．51±0．085BcL24．57±0．108Ac3．24±0．111BcL30．57±0．091Ab0．39±0．052BdL33．51±0．154Ad2．28±0．098Bd

数据为平均数±标准误差,同列数据中不同小写字母表示Pb处理与对照之间的差异达显著水平(P=0.05)；同行数据中不同大写字母表示同一处理梯度下,不同树种的差异达显著水平(P=0.05)

3 讨论

生物或非生物胁迫对植物光合作用各过程产生的影响都可通过叶片叶绿素荧光诱导动力学参数的变化反映出来[31]。光合作用反应中心PSII在胁迫条件下出现可逆性的失活或不可逆的伤害,使光合原初反应过程受阻,降低原初光能转换效率[32- 33],从而对光合反应机构产生严重的光抑制,极大地减弱电子传递的活性,最终导致植物对碳固定和同化效率的降低[34- 36]。本文通过对基于Lake模型的叶绿素荧光参数的研究发现,与对照相比,在3个不同Pb处理浓度下,栾树和木荷幼树叶片rETR、YII、qL均出现了不同程度的降低,这表明Pb胁迫导致PSII开放反应中心开放程度减少,引起 PSII有效光量子产量的下降,从而导致光合电子传递效率的明显降低,电子传递过程明显受到抑制,这会阻止ATP和NADPH的形成,降低栾树和木荷碳的固定和同化量[37- 38],使最大净光合速率(Pn)减小。同时,PSII的活性是通过叶片内D1蛋白不断地降解和重新合成来维持,由于植物在胁迫条件下,这种平衡会被打破,阻碍了PSII活性的修复,最终通过电子传递速率的抑制来体现[39- 41],这也进一步印证了本文对Pb胁迫造成两种供试植物rETR和YII下降的结果。另外,在本研究中,随着PAR的升高,在L1浓度下,YII和qL在两个树种上的降幅表现为：栾树>木荷,这说明在低浓度Pb胁迫下,木荷的非环式电子传递效率、光能转化能力高于栾树,随着Pb胁迫浓度的升高,在L2、L3浓度下,木荷的YII、qL较栾树相比出现大幅度的下降,且同光强下,木荷YII和qL的值低于栾树；同时,Pb2+胁迫引起的rETR的下降是由于线性电子传递受阻所致,栾树幼树叶片rETR在L1、L2、L3浓度下与对照相比,降幅分别在16%—27%,27%—31%,35%—65%之间,而木荷幼树叶片rETR为：19%—20%、28%—41%,62%—82%之间,对比二者不同Pb处理浓度后的下降幅度可以发现,rETR的下降幅度与YII和qL所表现出来的规律一致,这表明了当土壤中Pb浓度超过《土壤环境质量标准》 中三级标准(>500mg/kg)时,栾树幼树叶片比木荷幼树叶片有更高的PSII活性。

由于在不同的PAR下,PSII反应中心的氧化和还原处于不同的动态平衡中[20],因此,YII、rETR的下降必然会对PSII反应中心的能量分配有影响。本文通过对基于Lake模型的叶绿素荧光参数的研究发现,Pb胁迫导致两种植物随着PAR的升高,YII和qL和对照相比均呈下降趋势,根据Lake模型我们不难得出,Pb胁迫下的YNPQ和YNO较对照而言,会呈升高趋势,这与我们的试验结果一致。其中,YNO的变化趋势只受不同Pb胁迫程度的影响,对光强的反应不敏感。YII、qL和YNPQ的变化趋势与很多在Pb胁迫下基于Puddle模型的ETR、qP和NPQ的研究报道变化一致。

不同PAR下,Pb胁迫对栾树和木荷幼树叶片光系统中能量平衡和分配状况存在不同的影响。在不同Pb处理下,两种幼树叶片的YNPQ,均高于对照,表明两种幼树光保护机制已启动,在L1梯度下栾树YNPQ的上升幅度显著高于木荷(P<0.05),这说明栾树对Pb胁迫比木荷敏感(应激反应比木荷早出现)。在L2、L3梯度下,栾树YNPQ与L1梯度下相比变化不大,木荷虽然在L3处理后有大幅度上升,但同光强下的值小于栾树,说明栾树比木荷具有更强的抗Pb胁迫性,这与栾树具有更强的调节性能量耗散能力有密不可分的关系,加上栾树YNO只在L3处理后有明显的上升,且在每一个不同Pb胁迫梯度下,木荷的YNO均显著高于栾树(P<0.05),这表明了栾树的光保护能力比木荷更高,也进一步说明了栾树幼树比木木荷幼树耐Pb能力强,同时也反映了在L3处理下栾树叶片对Pb胁迫的响应已经由应激反应向生理损伤过渡。

上文中两种木本植物随着Pb胁迫浓度的增加,rETR随PAR的增加出现峰值,表明在Pb胁迫下光抑制现象会随PAR的升高提早出现,光抑制的出现往往是在植物受到超过自身光饱和点的光强照射时,但是本研究所用的栾树和木荷幼苗光饱和点[42- 44]通常是在1141—1711μmol m-2s-1和1366—1616μmol m-2s-1,本试验中采用的最大光强为1129μmol m-2s-1,未达到植物正常情况下的光饱和点,造成这种现象的原因,可能是由于供试植物在受到Pb胁迫时,会产生过多的活性氧(H2O2、HO)[45- 46],高浓度的活性氧会对植物造成氧化伤害[47- 48],随着Pb胁迫的加重,使D1蛋白净降解增加,阻碍PSII活性的修复,从而加剧光抑制[46]。同时,本研究对Fv/Fm和YNO的研究表明,两种供试植物在Pb胁迫下Fv/Fm下降的同时伴随着YNO的上升,说明高光强下,光反应的能量过多使PSII反应中心钝化,由此导致的光抑制现象是Pb胁迫造成光系统损伤的原因,这也为 PSII反应中心遭受破坏提供了佐证。

通过上述Pb胁迫下两种植物能量分配响应分析,本研究倾向于将YNPQ和YNO作为Pb胁迫的诊断及耐Pb性评价指标,因为YNPQ可作为衡量Pb胁迫下木本植物幼树叶片光保护能力强弱的指标,以上分析已证明,对Pb抗性强的品种其具有较高的光保护能力(栾树YNPQ>木荷YNPQ)。同时,YNO在不同PAR下几乎无变化,只受Pb胁迫浓度的影响,因此,也可以将YNO作为植物Pb胁迫的诊断指标。虽然两种木本植物在不同浓度的Pb胁迫下,YII均有不同的变化趋势,但本研究未将其作为木本植物抗Pb胁迫的诊断和抗性指标,究其原因,是因为在光合作用的过程中存在很多电子传递的途径[49],而且YII受PAR影响较大,因此不适合作为Pb胁迫的诊断指标。

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