超声微泡在脑恶性肿瘤治疗中的应用进展

闫紫薇，赵云，张瑞涛

(1三峡大学医学院，湖北宜昌443000；2三峡大学第一人民医院)

血脑屏障是由各种紧密连接蛋白连接的内皮细胞、星形胶质细胞的足突、周细胞及基底膜等构成，是神经血管单位的选择性屏障。血脑屏障仅允许小分子的亲脂性药物通过，阻止几乎所有大分子和99%的目前可用的小分子(>400 Da)药物进入大脑[1，2]，因此限制了药物对脑恶性肿瘤的治疗。克服血脑屏障的办法包括：打开颅骨直接将药物注射到靶区；通过鞘内注射药物到脑脊液，然后扩散到脑实质；改变药物结构使其能够被动扩散通过血脑屏障；通过化学方法开放血脑屏障等。但侵入性操作存在出血、感染的风险，化学方法靶向性较差或费用昂贵。微泡是一种声学造影剂，低频聚焦超声联合微泡已经被证实能够可逆性开放血脑屏障，有助于药物透过血脑屏障进入脑实质，同时微泡还可以作为药物载体联合低频聚焦超声靶向递送药物至脑内。本文主要阐述超声微泡开放血脑屏障的机制，阐述其介导药物治疗脑恶性肿瘤的作用及局限性。

1 超声微泡开放血脑屏障的机制

1.1 机械效应 低频聚焦超声联合微泡能够无创性、靶向性、可逆性开放血脑屏障，有利于促进药物在脑内释放。如果超声照射的声压比较低，微泡就会发生稳定空化。稳定空化产生的剪切应力和微流(微泡振荡产生微泡周围的流体流，即源于微泡的放射力)，造成局部冲击波。这些机械效应导致血脑屏障紧密连接的完整性下降[3，4]，内皮细胞腔面细胞膜变形或通透性增加[4]。超声辐照使微泡在毛细血管中快速膨胀和收缩，较大的微泡膨胀时导致血管壁机械拉伸，从而打开内皮细胞的紧密连接，导致血脑屏障的功能破坏。邓金木等[5]研究表明，聚焦超声联合微泡开放血脑屏障的程度要大于聚焦超声和微泡单独使用之和。

1.2 应激反应 低频超声穿透性强，可在不打开颅骨的情况下促使血脑屏障开放。当对生物组织进行超声照射时，可以诱导进入组织的微泡产生非线性振荡。微泡非线性振荡也可能减少局部血流量，使局部暂时性缺血，导致缺氧性应激反应，从而破坏并开放血脑屏障[6]。

1.3 促进内吞 超声微泡的稳态空化会对血管壁产生机械应力和剪切应力，影响内皮细胞中的机械敏感蛋白，将细胞外的机械信号转化成细胞内的生物化学信号[7]。caveolae是位于细胞质膜表面的囊状结构，其主要功能是介导跨细胞膜的内吞转运，其中最重要的标志性蛋白分子是caveolin-1，血脑屏障的开放程度与caveolin-1的表达水平一致。研究表明，聚焦超声联合微泡能够有效增加中枢神经系统微血管内皮细胞上caveolae的数量及caveolin-1蛋白表达水平，提示聚焦超声联合微泡开放血脑屏障时，caveolae介导的内吞作用发挥了非常重要的作用[5]。

1.4 抑制外排 血脑屏障既是物理屏障又是功能屏障。聚焦超声联合微泡可以影响紧密连接，限制被动的细胞旁途径以及刺激囊泡跨细胞转运[8]，具有暂时破坏血脑屏障的能力。P-糖蛋白是在血脑屏障内皮细胞膜上表达的最主要的多药耐药蛋白，其底物包括多柔比星(DOX)、柔红霉素、长春碱、长春新碱、依托泊苷等抗癌药物。P-糖蛋白可主动泵出大部分药物，减少药物在脑组织中的滞留和累积。此外，P-糖蛋白在肿瘤中的存在有助于癌细胞对化疗药物产生耐药性并降低疗效。研究发现，超声可以暂时抑制P-糖蛋白的表达。当声压幅度为0.55 MPa时，血脑屏障被破坏，P-糖蛋白被抑制达48 h，恢复时间为72 h；当声压幅度为0.81 MPa时，抑制效应可以持续72 h或更长。这些发现支持微泡联合聚焦超声通过抑制药物外排破坏血脑屏障功能，导致药物存在于脑实质中的时间增加，从而增加药物的功效[9]。

1.5 影响转运途经 研究表明，血脑屏障通透性增大的基础是caveolae介导的claudin-5表达水平的改变[10]。claudin-5在大脑所有血管内皮细胞上均有较高的表达，是紧密连接的关键性蛋白。聚焦超声联合微泡开放血脑屏障时，claudin-5表达水平显著下降，即紧密连接复合体减少，说明claudin-5介导的细胞旁途径在聚焦超声联合微泡打开血脑屏障中具有重要作用[5]。另有研究表明，claudin-5表达的变化要晚于caveolin-1，提示后者在血脑屏障开放早期具有重要意义[11]。由此可见，聚焦超声联合微泡所产生的机械力可能影响跨细胞途径和细胞旁途径，从而导致血脑屏障开放。

2 超声微泡的载药机制

2.1 作为载体传送药物 利用超声微泡包裹药物，可以作为有效载体，携带治疗药物转移运到靶位点或目标组织，在转运过程中微泡可以保护药物有效载荷不被酶破坏，从而实现高精度的递送治疗药物[12]。超声微泡携带药物或基因的方式有很多种，如：将基因或药物直接黏附于微泡壳膜表面，使用带正电荷脂质层壳微泡，静电结合带负电荷的核酸，例如siRNA、miRNA、mRNA和质粒DNA；将基因或药物包裹入微泡内部，疏水性药物可以封装在稳定微泡的脂质或聚合物壳内；将基因或药物包裹在双分子层微泡内外层之间。超声脉冲引起的极端振荡导致微泡破裂，药物被释放。

2.2 增加药物吸收 微泡在肿瘤微血管中震荡可以增加内皮细胞的通透性，增强药物外渗，增加细胞对药物的吸收，从而导致肿瘤血管破坏及营养物质供应减少[12]。稳态和瞬态空化现象在增加生物屏障(包括血管内皮和细胞质膜)的瞬时通透性中都会发挥作用。通过影响跨细胞途经、细胞旁路途经及增加细胞膜孔隙的方式导致生物屏障的通透性增加，有利于细胞摄取及外渗治疗性药物分子[13～15]。这些载有药物或基因的微泡在体内的循环可以使用超声对比成像进行追踪，随后使用超声脉冲破坏微泡，使有效载荷在靶组织或靶器官释放[16]。

3 超声微泡开放血脑屏障在治疗脑恶性肿瘤中的应用

3.1 超声微泡在化疗药物治疗脑恶性肿瘤中的作用 卡莫司汀是治疗脑胶质瘤的常用化疗药物。载有卡莫司汀的脂质微泡联合聚焦超声实现了卡莫司汀在脑内靶向释放，卡莫司汀微泡使卡莫司汀的半衰期延长5倍，并且增强了药物向大脑的递送效率。研究表明，卡莫司汀微泡与单独使用卡莫司汀的对照组相比对，肝脏的毒性更小，对肿瘤的治疗效果更好，实验动物的中位生存时间及最大存活时间显著延长。

血管内皮生长因子受体2(VEGF-R2)在胶质瘤内皮细胞中过度表达，其主要功能是介导细胞增殖和迁移，并导致肿瘤区域的血管过度生成。研究者设计了一种结合VEGF-R2-配体和卡莫司汀的微泡，命名为VEGF-BCNU-MBs，靶向递送药物至过度表达VEGF-R2受体的肿瘤血管系统，免疫荧光染色证实肿瘤区域药物浓度的累积增高。VEGF-BCNU-MBs与载卡莫司汀微泡相比，肝脏毒性更小，对肿瘤的抑制作用更强[17]。

紫杉醇是一种广泛应用于颅外癌症的抗肿瘤药物，脂质体能够包封疏水性紫杉醇，从而减少药物的毒性，同时增强其治疗效果，紫杉醇脂质体(PTX-LIPO)是一种有前途的抗肿瘤制剂，但血脑屏障及血液肿瘤屏障(BTB)的存在使得脂质体药物难以穿过，导致其在脑恶性肿瘤的应用受到限制。Shen等[18]研究表明，聚焦超声联合微泡可以提高PTX-LIPO穿透血脑屏障及血液肿瘤屏障的递送效率。与未经聚焦超声治疗组相比，超声微泡组中胶质母细胞瘤中累积的药物浓度增加了2倍，且肿瘤裸鼠的中等存活时间延长了20.8%。

DOX广泛用于颅外肿瘤的治疗，但对颅内恶性肿瘤无效，其原因也是由于DOX的脂质体不易穿越完整的血脑屏障。Treat等[19]研究表明，聚焦超声联合微泡破坏了完整的血脑屏障，可以显著增加DOX脂质体治疗脑恶性肿瘤效果。

目前中枢神经系统白血病(白血病细胞浸润脑膜或脑实质)常用的治疗方法有放疗、全身化疗以及鞘内注药化疗，存在脑组织损伤、出血、感染、脑脊液漏、血栓等风险。阿糖胞苷是治疗急性白血病的常用化疗药物，利用低频聚焦超声联合微泡能够显著增加脑组织阿糖胞苷浓度[20]，避免大剂量静脉给药可能带来的全身不良反应。

3.2 超声微泡在生物免疫治疗脑恶性肿瘤中的应用 HER2靶向抗体(即曲妥珠单抗和培妥珠单抗)可以延长颅外转移HER2阳性乳腺癌患者的存活率，但是脑转移瘤对这些药物的反应很差。Kobus等[21]研究表明，使用超声微泡联合HER2靶向抗体可以抑制乳腺癌脑转移的生长，而且他们的研究还发现，对HER2单抗不敏感的脑恶性肿瘤患者也可能受益于聚焦超声介导的血脑屏障破坏。

使用低密度脂蛋白(LDL)纳米颗粒结合超声微泡开放血脑屏障运送二十二碳六烯酸(DHA)到大脑，可以用于急性脑损伤的区域治疗或靶向递送药物治疗脑恶性肿瘤。使用超声微泡联合LDL-DHA纳米颗粒，DHA不仅进入大脑，而且能摄入脑细胞，使脑内的DHA水平增加2倍。

抗肿瘤自杀基因疗法是将无毒前药转化为细胞毒性药物的基因导入肿瘤细胞，而达到抑制或杀伤肿瘤组织的目的，是治疗脑恶性肿瘤的一种新疗法。将单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-tk)基因转移到肿瘤细胞中，可增强细胞对抗病毒药物的敏感性。HSV1-tk可以将更昔洛韦(GCV)磷酸化为单磷酸，然后通过细胞激酶磷转化为二磷酸盐和三磷酸盐，GCV的二磷酸盐和三磷酸盐对处于增殖期的哺乳动物细胞有很强的毒性作用，从而杀伤处于活跃增殖状态的肿瘤细胞。Yang等[22]报道，超声微泡联合GCV与单独GCV治疗相比，能更显著地抑制带有荧光素酶/绿色荧光蛋白/HSV1-tk三重报道基因的原位F98神经胶质瘤的生长。Yang等[23]研究显示，聚焦超声诱导的血脑屏障破坏能够将高剂量的化疗药物集中到脑恶性肿瘤中，并增强其抗肿瘤作用。

白细胞介素12(IL-12)不仅是免疫系统的重要成分，还是一种潜在的强效抗肿瘤细胞因子。Pin等[24]研究发现，IL-12腹腔给药联合超声微泡打开血脑屏障组同对照组相比，其脑恶性肿瘤中的IL-12增加更显著，CTL增加和CTL/Treg比例增加，更有助于抑制肿瘤发展及延长动物的存活时间。说明聚焦超声开放血脑屏障可以增强免疫调节剂递送至大脑，提高了脑恶性肿瘤治疗中的抗癌免疫应答。

3.3 超声微泡在放疗治疗脑恶性肿瘤中的作用 硼中子俘获治疗是临床上治疗神经胶质瘤的生物靶向放射治疗方法，该疗法是将含硼的药物施用于癌细胞然后用热中子照射，使硼原子与热中子发生俘获反应，产生的射线会破坏癌细胞的遗传物质并使其死亡。超声联合微泡打开血脑屏障的方式使硼苯丙氨酸的脑内吸收增加，提高了硼中子俘获治疗神经胶质瘤的效果。

4 超声微泡应用的局限性

4.1 超声微泡可能造成脑损伤 超声与微泡相互作用时不仅释放药物，还可能诱导血脑屏障的组织学损伤。低强度聚焦超声联合微泡打开血脑屏障时，机械声学空化效应会导致热休克蛋白、IL-1、IL-18、TNF-α升高，提示可能存在无菌性炎症反应。但也有研究提出了相反观点，认为聚焦超声联合微泡可以安全可控地对恒河猴进行脑内靶向给药，在0.20～0.30 MPa的声压强度下，可以破坏血脑屏障并且没有脑组织损伤，没有行为改变及视力损伤，由此说明特定参数的聚焦超声联合微泡对于非人类灵长类动物是安全的[25,26]。

有人提出，在聚焦超声诱导的血脑屏障破坏模型中，可通过低强度脉冲超声来减小脑损伤，有效调节聚焦超声诱导的血脑屏障破坏的通透性和时间窗口，使药物可以精准控释到大脑中。在聚焦超声联合微泡介导血脑屏障破坏中，Su等[27]最先研究了使用低强度脉冲超声来调节血脑屏障持续时间并减少脑水肿，结果表明低强度脉冲超声治疗能有效减轻大鼠脑损伤、神经元损伤和细胞凋亡。因此，选择合适的治疗参数能有效保障治疗的安全性。

4.2 超声微泡可能导致的其他并发症 Aryal等[28]在使用DOX脂质体联合超声微泡治疗胶质瘤大鼠时发生的一些不良反应，包括广泛的瘤内出血、肿瘤周围脑组织损伤、肿瘤位点组织缺失、活动受限、皮肤毒性等。瘤内出血可能与肿瘤的血管壁坏死有关，皮肤毒性可能与DOX已知的不良反应有关。由于目前的研究样本量有限，未来还需要研究者做更多的工作来研究相关治疗的有效性的不良反应的发生率。

5 小结与展望

血脑屏障限制了脑恶性肿瘤的药物治疗，随着分子影像技术学的发展，超声微泡为脑恶性肿瘤的治疗带来了新的希望。超声微泡利用空化效应能可逆性地开放血脑屏障，促进药物进入脑内，且微泡还能作为药物载体，保护药物在转运途中不被酶破坏。研究者将超声微泡与化疗药物、生物免疫治疗、放疗等相结合，提供了新的治疗方法。但现在的研究大多数还停留在临床前的研究，要将其应用于临床还需要解决一些问题：首先，超声联合微泡开放血脑屏障的安全参数需要进一步明确，需要更多的试验来提高其安全性；其次，超声微泡用于开放血脑屏障治疗脑恶性肿瘤的相关并发症及不良反应还需要进一步明确，并提出解决的方法。