上调miR-449a表达对肝癌细胞生长和侵袭能力的影响

邓雪松，潘红艳，成俊，卢贵余，詹勇强，倪勇，王成友

（1. 深圳大学第一附属医院/深圳市第二人民医院 肝胆外科，广东 深圳 518035；2. 深圳市南山区人民医院 消化内科，广东 深圳 518052）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）属于高度恶性肿瘤，是我国癌症中的第二号杀手，严重威胁国人健康，并且造成巨大的经济和社会负担[1]。目前，随着肝切除技术的不断进步和多种治疗手段日益完善[2-4]，HCC疗效有了跨越性的进步，但是远期存活率并没有显著提高，其重要的原因是HCC自身的分子生物学行为容易导致术后的复发与转移[5-7]。新近研究[8]表明，HCC癌组织中异常表达的miR-449a与术后肿瘤复发、转移密切相关，是导致患者不良预后的重要因素之一。然而，关于miR-449a如何影响HCC分子生物学行为，调控HCC发生发展的病理过程，目前鲜有研究报道。为此，本研究采用脂质体转染技术，诱导HCC细胞miR-449a表达上调，进行体外细胞功能学实验和体内成瘤实验，探讨上调miR-449a表达对HCC细胞生长和侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株与细胞培养

永生系肝细胞L02，HCC细胞株HepG2、Hep3B、SMMC-7721和Bel-7402，均购自中国科学院上海细胞库，L02采用含10%FBS的RPMI 1640培养基进行培养，HCC细胞株采用含10%FBS的DMEM培养基进行培养。细胞单层贴壁，密度达90%，进行细胞传代。

1.2 实验裸鼠

3～4周龄雌性BALB/c裸鼠购自中国科学院上海实验动物中心。

1.3 细胞冻存与复苏

收集对数生长期细胞，胰酶消化，500r/min离心5 min，沉淀的细胞重新悬浮于冻存液（5×106细胞: 0.5 mL冻存液），加入冻存管中，每管1.0 mL，放至程序降温盒中置于-80 ℃冰箱，48 h后移入液氮中保存。液氮罐取出冻存管，立即置入37 ℃水浴中，待完全解冻后，细胞悬液移至15 mL的离心管中，并加入新鲜培基5 mL，500r/min离心5 min，弃上清，将细胞重新悬浮于1 mL新鲜培养液并移至细胞培养瓶，37 ℃、5%CO2中培养。

1.4 主要仪器与试剂

低温高速离心机（德国Eppendorf公司）；-80 ℃低温冰箱（日本Sanyo公司）；960型号酶标仪（日本Meter Tech公司）；LightCycler®480 IISystem、荧光定量PCR专用96孔板（瑞士Roche公司）；流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）；Transwell小室（美国Millipore公司）；TRIzol细胞裂解液、Lipofectamine 2000转染试剂盒（美国Invitrogen公司）；miScript II RT试剂盒、miScript SYBR Green PCR试剂盒、HsmiR-449-1 miScript引物和Hs-RNU6-2-11 miScript引物（德国Qiagen公司）；DMEM、RPMI 1640、F B S和胰蛋白酶消化液（美国G i b c o公司）；CCK-8细胞活性检测试剂盒（日本Dojindo公司）；细胞凋亡检测试剂盒、Matrigel胶（美国BD公司）。

1.5 主要方法

1.5.1 qRT-PCR检 测 miR-449a表 达 TRIzol裂解提取总RNA（包含miRNA），使用核酸蛋白测定仪以吸光度法测量RNA浓度，按照miScript II试剂盒说明书配成20 μL反应体系进行逆转录cDNA，根据miScript SYBR试剂盒说明书配制20 μL反应体系进行实时定量PCR，通过荧光定量PCR获取Ct值（threshold cycle number，阈值循环数），采用U6作为内参照。计算基因相对表达量用2-△△Ct表示，该数值表示目的基因的表达量相对于对照样品表达量的位数。每个样品设定3个复孔，进行3次实验，计算各样本的平均Ct值和△Ct，并由此计算△△Ct=△CT目的-△Ct对照。

1.5.2 细胞转染 siRNA由上海吉玛公司设计、合成（has miR-449a模拟物正义链：5'-UGG CAG UGU AUU GUU AGC UGG U-3'，反义链：5'-CAG CUA ACA AUA CAC UGC AAU U-3'；阴性对照正义链：5'-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3'，反义链：5'-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3'）。转染前1 d，5×105细胞/孔接种于6孔板，每孔加入2 mL含10%FBS的DMEM培养基，在24 h内使每孔细胞密度达到70%～90%；转染当天，弃培养液，PBS清洗细胞2次，每孔加入1.5 mL无血清DMEM培养液。混匀Lipofectamin 2000试剂：取2个1.5 mL EP管，均加入250 μL无血清DMEM培养液，其中1管加入10 μL Lipofectamin 2000试剂，轻轻混匀，室温放置5 min；另1管加入 5 μL 浓度为 20 μM has miR-449a mimic（或mimic-NC）；将2管液体混合，轻柔混匀，室温放置20 min，形成复合物。将500 μL复合物加到含有细胞和培养基的6孔板中，摇晃并混匀，放入5%CO2、37℃培养箱中孵育6 h，移液器吸除含Lipofectamin 2000复合物的培养基，重新加入10%FBS的DMEM培养基继续培养48 h。

1.5.3 CCK-8方法检测细胞的增殖 选取对数生长期的细胞接种于96孔板，每孔加入1×104个细胞悬液，设6个平行孔，重复3次，分别于24、48、72 h后取出培养板，吸尽原培养液，加入培养液与CCK-8按1:9混合的反应液，每孔加入200 µL，并设置6个单纯检测液的培养孔作为空白对照，继续37 ℃培养箱内孵育1～2 h，取出培养板采用酶标仪于450 nm处检测各孔吸光度值（OD值），每孔实测OD值减去空白对照OD值，取3次实验的平均值，记录为A450值，并绘制细胞生长曲线。

1.5.4 流式细胞仪检测细胞周期 细胞经胰酶消化后收集至离心管中，PBS洗涤2次，用70%乙醇重悬放置-20 ℃冰箱固定过夜，离心，去上清，PBS洗涤2次，加入DNA Prep染色剂，染色30 min后上机检测细胞周期。

1.5.5 Transwell小室实验检测细胞的侵袭能力将 20 µL Matrigel（原液为 9 mg/mL，用无血清DMEM培养液按1:9稀释）涂抹于Transwell小室内表面，将小室放入24孔板中，于37 ℃培养箱中放置30 min，制备Matrigel凝胶；吸取200 μL含总量为4.8×104个细胞的细胞悬液，均匀滴加于Transwell小室内；24孔板内分别加入600 µL/孔含20%FBS的DMEM培养基并将小室浸入其中；继续培养48、72 h后取出小室，置于甲醇中固定15 min；弃去固定液，加适量0.1%结晶紫染色20 min；PBS漂洗3次，用棉签擦尽小室内的凝胶和未穿透凝胶的细胞；切膜，放置载玻片上进行封片；高倍镜下随机选取5个视野进行细胞计数（每高倍视野，HPF）及拍照。

1.5.6 建立皮下种植瘤的裸鼠模型 取对数生长期成功转染的Bel-7402细胞（miR-449a模拟物转染和阴性对照序列转染），经胰酶消化，PBS洗涤2次，计数并调整细胞浓度2.5×107/mL，以0.4 mL（1×107细胞/只）接种于裸鼠右前肢腋窝皮下，分别记为miR-449a模拟物组和阴性对照组，每组接种6只；观察皮下成瘤情况，皮下成瘤28 d后，处死裸鼠，切除并取出种植瘤，电子天秤称重（g），游标卡尺测量瘤体长度（L）、宽度（W），按L×W2/2计算瘤体近似体积（mm3）。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 miR-449a在Bel-7402细胞表达的水平最低

检测miR-449a在永生系肝细胞L02和4种具有不同复发转移潜能H C C细胞株H e p G 2、SMMC-7721、Hep3B和Bel-7402的表达水平，以L02作为参照，上述5种细胞株miR-449a的相对表达水平依次为：1.0±0.0、0.76±0.09、0.48±0.11、0.41±0.09、0.28±0.05。实验结果表明，miR-449a在HCC细胞株的表达水平均明显低于L02细胞（均P＜0.05）（图1），其中HCC细胞株Bel-7402的miR-449a表达水平最低。为此，实验选取Bel-7402细胞作为进一步研究的对象。

2.2 miR-449a表达上调的Bel-7402细胞制备情况

Lipofectamine 2000介导miR-449a模拟物（miR-449a模拟物组）和阴性对照序列（阴性对照组）转染Bel-7402细胞。qRT-PCR检测结果表明miR-449a模拟物组细胞miR-449a表达水平明显高于阴性对照组细胞（P＜0.001）（图2）。

图1 各组细胞株miR-449a的表达水平Figure 1 Expression levels of miR-449a in each studied cell line

图2 不同转染Bel-7402细胞miR-449a的表达水平比较Figure 2 Comparison of miR-449a expression levels in Bel-7402 cells with different transfections

2.3 上调miR-449a表达对Bel-7402细胞增殖活性的影响

CCK-8检测结果表明，miR-449a模拟物组在转染24、48、72 h的增殖活性（A450值）分别为0.226±0.150、0.279±0.017、0.371±0.012，均明显低于阴性对照组细胞相应时间点A450值（0.338±0.016、0.411±0.019、0.465±0.014）（均P＜0.001）（图3）。

图3 miR-449a高表达对Bel-7402细胞增殖的影响Figure 3 In fl uence of miR-449a overexpression on proliferation of Bel-7402 cells

2.4 上调miR-449a表达能够阻滞Bel-7402细胞生长周期的转换

流式细胞仪检测结果表明，miR-449a模拟物组细胞处于G1期的比例明显高于阴性对照组[（69.20±0.61）%vs.（58.68±0.78）%，P＜0.001]（图4）。

图4 miR-449a高表达对Bel-7402细胞G1/S期转换的影响Figure 4 In fl uence of miR-449a overexpression on G1/S switch in Bel-7402 cells

2.5 上调miR-449a表达对Bel-7402细胞体外侵袭能力的影响

侵袭实验结果表明，miR-449a模拟物组细胞穿过Transwell小室的细胞数明显少于阴性对照组[（396.67±15.28）/HPFvs.（723.33±32.15）/HPF，P＜0.001]（图5）。

图5 miR-449a高表达对Bel-7402细胞侵袭能力的影响（×200）Figure 5 In fl uence of miR-449a overexpression on invasion ability in Bel-7402 cells (×200)

2.6 上调miR-449a表达对Bel-7402细胞体内成瘤能力的影响

采用皮下注射肿瘤细胞的方法，成功建立皮下种植瘤的裸鼠模型（图6）。实验结果表明，miR-449a模拟物组移植后瘤体的质量明显低于阴性对照组[（0.748±0.408）gvs.（1.234±0.134）g，P＜0.0 5]，瘤体的体积也明显小于阴性对照组[（733.667±340.100）mm3vs.（1 400.500±88.245）mm3，P＜0.001]（图7）。

图6 裸鼠成瘤情况Figure 6 Tumor formation in the nude mice

图7 两组移植瘤质量与体积的比较Figure 7 Comparison of the weight and volume of xenografts between the two groups

3 讨 论

近年来，大量的研究[9-11]证实miRNA在HCC病理过程中表现癌基因或抑癌基因的作用，调控HCC细胞的生长[12]、分化[13]、凋亡[14]、血管生成[15]以及侵袭转移[16-18]等分子生物行为。miR-96[19]、miR-182[19]、miR-210[20]和miR-3127[21]在HCC癌组织的表达上调，可以通过逃避或削弱相关抑癌基因或抑癌因子的调控，发挥癌基因的作用，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和成瘤能力。我们研究团队前期实验表明，在HCC癌组织和细胞株中miR-34a[22]、miR-145[23]表达下调，其抑癌效应被剥弱，进而导致HCC细胞的增殖、生长和侵袭能力的增强。最近的研究[8]表明，HCC癌组织中miR-449a异常表达参与了HCC发生发展的过程，其对HCC分子生物行为的调控作用也逐渐得到了关注。为研究miR-449a异常表达对HCC分子生物行为的影响，本实验首先检测了miR-449a在肝细胞L02和4种HCC细胞株HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Bel-7402的表达水平，结果表明miR-449a在HCC细胞株的表达水平均显著低于L02细胞，其中HCC细胞株Bel-7402的miR-449a表达水平最低。为此，本实验选取Bel-7402细胞作为进一步研究的对象。本研究采用脂质体转染技术，诱导Bel-7402细胞miR-449a表达水平改变，成功上调miR-449a的表达。进一步体外细胞功能实验表明，上调miR-449a表达能够抑制Bel-7402细胞的增殖、阻滞细胞G1/S期的转换和减弱细胞的侵袭能力，提示改变miR-449a表达水平对HCC细胞的分子生物行为具有调控作用。

成瘤作用是HCC细胞恶性生物行为的一个重要特性，反映了肿瘤细胞的生长和侵袭能力[24-26]。为验证miR-449a在体内是否具有调控HCC生长的效应，本研究进行体内胞实验，采用转染miR-449a模拟物的Bel-7402细胞和阴性对照序列的Bel-7402细胞对裸鼠进行皮下注射，成功制备种植瘤的裸鼠模型。实验结果显示，miR-449a模拟物组肿瘤的平均质量和体积均显著低于阴性对照组，表明上调miR-449a表达能够抑制Bel-7402细胞体内成瘤的能力，提示miR-449a在体内具有抑制肿瘤生长的效应。

综上所述，本研究表明miR-449a在HCC细胞株呈现表达下调，通过上调miR-449a在Bel-7402细胞的表达水平，能够抑制细胞的增殖活性、阻滞细胞周期G1/S期的转换、减弱细胞的体外侵袭能力和体内成瘤能力。因此，下一步将深入探讨miR-449a作用的靶基因，以及相关癌信号通路重要功能蛋白的表达和活性的改变有关，进一步阐明miR-449a调控HCC分子生物行为的具体机制，寻求能有效干预HCC无限制生长和高度侵袭转移的分子策略。

[1] 陈万青, 郑荣寿, 张思维, 等. 2012年中国恶性肿瘤发病和死亡分析[J]. 中国肿瘤, 2016, 25(1):1–8. doi:10.11735/j.issn.1004–0242.2016.01.A001.Chen WQ, Zheng RS, Zhang SW, et al. Report of Cancer Incidence and Mortality in China, 2012[J]. China Cancer, 2016, 25(1):1–8.doi:10.11735/j.issn.1004–0242.2016.01.A001.

[2] 王志明, 周乐杜, 吕新生, 等. 原发性肝癌治疗方法的选择:附265例报告[J]. 中国普通外科杂志, 2004, 13(12):908–911.Wang ZM, Zhou LD, Lu XS, et al. The selection of treatment modalities for primary liver cancer:a report of 265 cases[J]. Chinese Journal of General Surgery, 2004, 13(12):908–911.

[3] 中华外科学会肝脏外科学组. 原发性肝癌外科治疗方法的选择[J]. 中国普通外科杂志, 2001, 10(2):99–101.Liver Surgery Group of Chinese Surgery Association. Selection of surgical treatment of primary hepatic cancer[J]. Chinese Journal of General Surgery, 2001, 10(2):99–101.

[4] 戴卫东, 胡继雄, 苗雄鹰, 等. 腹腔镜一期开腹二期ALPPS治疗巨块型肝癌的疗效分析[J]. 中国普通外科杂志, 2017, 26(8):1042–1048. doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2017.08.013.Dai WD, Hu JX, Miao XY, et al. Efficacy of laparoscopic fi rst stage and open second stage ALPPS for huge hepatocellular carcinoma[J].Chinese Journal of General Surgery, 2017, 26(8):1042–1048.doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2017.08.013.

[5] Oliveri RS, Wetterslev J, Gluud C. Hepatocellular carcinoma[J].Lancet, 2012, 380(9840):470–471. doi: 10.1016/S0140–6736(12)61285–9.

[6] Díaz-González Á, Forner A. Surveillance for hepatocellular carcinoma [J]. Best Pract Res Clin Gastroenterol, 2016, 30(6):1001–1010. doi: 10.1016/j.bpg.2016.10.006.

[7] 蔡云峰, 苏树英, 甄作均. 肝癌组织c-met表达与肝癌术后预后的关系[J]. 中国普通外科杂志, 2013, 22(12):1580–1584. doi:10.7659/j.issn.1005–6947.2013.12.011.Cai YF, Su SY, Zhen ZJ. Relationship between c-met expression level and postoperative prognosis of hepatocellular carcinoma[J].Chinese Journal of General Surgery, 2013, 22(12):1580–1584.doi:10.7659/j.issn.1005–6947.2013.12.011.

[8] Chen SP, Liu BX, Xu J, et al. MiR-449a suppresses the epithelialmesenchymal transition and metastasis of hepatocellular carcinoma by multiple targets[J]. BMC Cancer, 2015, 15:706. doi: 10.1186/s12885–015–1738–3.

[9] Callegari E, Elamin BK, Sabbioni S, et al. Role of microRNAs in hepatocellular carcinoma: a clinical perspective[J]. Onco Targets Ther, 2013, 6:1167–1178. doi: 10.2147/OTT.S36161.

[10] 周密, 汤成泳, 张国庆, 等. 上调miR-101对肝细胞癌生物学行为的影响[J]. 中国普通外科杂志, 2015, 24(7):963–969. doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2015.07.009.Zhou M, Tang CY, Zhang GQ, et al. Impact of upregulating miR-101 on biological behavior of hepatocellular carcinoma[J]. Chinese Journal of General Surgery, 2015, 24(7):963–969. doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2015.07.009.

[11] Xu J, Li J, Zheng TH, et al. MicroRNAs in the Occurrence and Development of Primary Hepatocellular Carcinoma[J]. Adv Clin Exp Med, 2016, 25(5):971–975. doi: 10.17219/acem/36460.

[12] Lin J, Huang S, Wu S, et al. MicroRNA-423 promotes cell growth and regulates G(1)/S transition by targeting p21Cip1/Waf1 in hepatocellular carcinoma[J]. Carcinogenesis, 2011, 32(11):1641–1647. doi: 10.1093/carcin/bgr199.

[13] 张立, 张迪, 李孝彬, 等. microRNA-616在肝癌中的表达及临床意义[J]. 中国普通外科杂志, 2016, 25(7):991–997. doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2016.07.010.Zhang L, Zhang D, Li XB, et al. Expression of microRNA-616 in hepatocellular carcinoma and its clinical significance[J]. Chinese Journal of General Surgery, 2016, 25(7):991–997. doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2016.07.010.

[14] Xu J, Zhu X, Wu L, et al. MicroRNA-122 suppresses cell proliferation and induces cell apoptosis in hepatocellular carcinoma by directly targeting Wnt/β-catenin pathway[J]. Liver Int, 2012,32(5):752–760. doi: 10.1111/j.1478–3231.2011.02750.x.

[15] Yang X, Zhang XF, Lu X, et al. MicroRNA-26a suppresses angiogenesis in human hepatocellular carcinoma by targeting hepatocyte growth factor-cMet pathway[J]. Hepatology, 2014,59(5):1874–1885. doi: 10.1002/hep.26941.

[16] Li N, Fu H, Tie Y, et al. miR-34a inhibits migration and invasion by down-regulation of c-Met expression in human hepatocellular carcinoma cells[J]. Cancer Lett, 2009, 275(1):44–53. doi: 10.1016/j.canlet.2008.09.035.

[17] Yang XW, Zhang LJ, Huang XH, et al. miR-145 suppresses cell invasion in hepatocellular carcinoma cells: miR-145 targets ADAM17[J]. Hepatol Res, 2014, 44(5):551–559. doi: 10.1111/hepr.12152.

[18] 梁治坤, 程凡天, 胡走肖, 等. miR-150–5p抑制肝癌细胞的迁移和侵袭及其机制[J]. 中国普通外科杂志, 2016, 25(8):1175–1179.doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2016.08.015.Liang ZK, Cheng FT, Hu ZX, et al. Inhibitory effect of miR-150–5p on migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells and its mechanism[J]. Chinese Journal of General Surgery, 2016,25(8):1175–1179. doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2016.08.015.

[19] Wang TH, Yeh CT, Ho JY, et al. OncomiR miR-96 and miR-182 promote cell proliferation and invasion through targeting ephrinA5 in hepatocellular carcinoma[J]. Mol Carcinog, 2016, 55(4):366–375.doi: 10.1002/mc.22286.

[20] Ying Q, Liang L, Guo W, et al. Hypoxia-inducible microRNA-210 augments the metastatic potential of tumor cells by targeting vacuole membrane protein 1 in hepatocellular carcinoma[J].Hepatology, 2011, 54(6):2064–2075. doi: 10.1002/hep.24614.

[21] Jiang J, Zhang Y, Guo Y, et al. MicroRNA-3127 promotes cell proliferation and tumorigenicity in hepatocellular carcinoma by disrupting of PI3K/AKT negative regulation[J]. Oncotarget, 2015,6(8):6359–6372.

[22] Cheng J, Zhou L, Xie QF, et al. The impact of miR-34a on protein output in hepatocellular carcinoma HepG2 cells[J]. Proteomics,2010, 10(8):1557–1572. doi: 10.1002/pmic.200900646.

[23] Wang Y, Hu C, Cheng J, et al. MicroRNA-145 suppresses hepatocellular carcinoma by targeting IRS1 and its downstream Akt signaling[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2014, 446(4):1255–1260. doi: 10.1016/j.bbrc.2014.03.107.

[24] Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation[J]. Cell, 2011, 144(5):646–674. doi: 10.1016/j.cell.2011.02.013.

[25] Li Y, Kowdley KV. Cellular microRNA and the tumorigenesis of hepatocellular carcinoma[J]. Ann Hepatol, 2012, 11(2):272–274.

[26] 阮柏, 刘杰, 窦科峰. 肝脏干细胞恶性转化的研究进展[J]. 国际外科学杂志, 2013, 40(1):42–46. doi:10.3760/cma.j.issn.1673–4203.2013.01.014.Ruan B, Liu J, Du KF. Progress on malignant transformation of hepatic stem cells[J]. International Journal of Surgery, 2013,40(1):42–46. doi:10.3760/cma.j.issn.1673–4203.2013.01.014.