miR-101对胃癌化疗耐药的影响及其机制

王新平，王彩云，张建武

(1 洪湖市第二人民医院，湖北洪湖433202；2 青岛市即墨区健康教育所；3湖北省中南医院 )

miRNA是由19～23个核苷酸组成的非编码小分子RNA。已有研究证实，miRNA可通过调节药物代谢酶活性诱导肿瘤化疗耐药[1]。miR-101是近年发现的一个肿瘤抑制miRNA，在多种恶性肿瘤中发挥类似抑癌基因作用[2]，但其是否参与胃癌化疗耐药尚不清楚。2015年8月～2017年8月，本研究观察了miR-101对胃癌细胞化疗耐药的影响，并探讨其调控机制。现报告如下。

1 材料

胃癌细胞SGC-7901(以下称SGC-7901细胞)、顺铂(DDP)耐药胃癌细胞SGC-7901(以下称SGC-7901/DDP细胞)，购自美国菌种保藏中心；人正常胃黏膜上皮细胞GES1(以下称GES1细胞)，购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。DDP，美国Sigma公司。miR-101 mimic(miR-101模拟物)及其阴性对照序列(mimic control)，广州锐博生物科技有限公司。所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成。凝胶成像分析系统，郑州博邦科贸有限公司；DYY-10C电泳仪，北京六一生物科技有限公司；实时荧光定量PCR仪，美国ABI公司。MTT试剂，美国Sigma公司；Lipofectamine2000，美国Invitrogen公司；TRIzol试剂、miRNA cDNA Synthesis Kit、PrimeScript RT Reagent Kit，日本TaKaRa公司；细胞裂解液，江苏碧云天生物技术研究所；P-糖蛋白(P-gp)抗体、c-met抗体，美国Cell Signaling Technology公司；β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，美国Santa Cruz公司；psiCHECK-2质粒，南京金斯瑞生物科技有限公司；Dual Luciferase Assay Kit，美国Promega公司。

2 方法与结果

2.2 SGC-7901/DDP细胞相关指标观察 将SGC-7901细胞、SGC-7901/DDP细胞接种于含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素的RPMI 1640培养基，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。为了维持SGC-7901/DDP细胞耐药表型，SGC-7901/DDP细胞RPMI 1640培养基中加入0.5 μg/mL顺铂。将GES1细胞接种于含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素的DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。当细胞贴壁生长时，用0.25%胰酶消化，按1∶3传代。取传3代、对数生长期细胞进行后续实验。

2.2.1 miR-101表达 采用实时荧光定量PCR法。取传3代、对数生长期GES1细胞、SGC-7901细胞、SGC-7901/DDP细胞，采用TRIzol法提取细胞总RNA，经紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳鉴定，提取的总RNA符合实验要求。按miRNA cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒说明将总RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。引物序列：miR-101上游引物5′-GGCTCTGAGTGGTTGAGC-3′、下游引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′，内参U6上游引物5′-GCTTGCGCACGAGATATAGTAAAAT-3′、下游引物5′-CCGTTGAGCAATTTGCCTGTGAT-3′。按PCR扩增试剂盒说明配制反应体系。PCR反应条件：95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，共30个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。结果显示，GES1细胞、SGC-7901细胞、SGC-7901/DDP细胞miR-101 mRNA相对表达量分别为1.01±0.04、0.61±0.05、0.45±0.03，三种细胞miR-101 mRNA相对表达量两两比较P均<0.05。

2.2.2 c-met 表达 ①c-met mRNA表达：取传3代、对数生长期GES1细胞、SGC-7901细胞、SGC-7901/DDP细胞，采用实时荧光定量PCR法检测其c-met mRNA相对表达量。引物序列：c-met上游引物5′-TGAACTGCATACTACGCTCAAGA-3′、下游引物5′-CGGATTCGTCACAATGTGTTC-3′，内参β-actin上游引物5′-TGGCCCCAGCACAATGAA-3′、下游引物5′-CTAAGAGATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。具体步骤参照2.2.1。三种细胞c-met mRNA相对表达量分别为1.04±0.07、1.57±0.15、2.76±0.24。三种细胞c-met mRNA相对表达量两两比较P均<0.05。②c-met蛋白表达：采用Western blotting法。取传3代、对数生长期GES1细胞、SGC-7901细胞、SGC-7901/DDP细胞，采用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法蛋白定量合格。取部分细胞总蛋白，加入上样缓冲液，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分变性。取变性蛋白30 μg进行10% SDS-PAGE(80 V恒压30 min，120 V恒压2 h)。电泳结束，采用湿转法将蛋白电泳产物转印至PVDF膜上，转膜条件：250 mA恒流70 min；5%脱脂牛奶封闭1.5 h，分别加入c-met一抗(1∶500)或β-actin一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。次日加入辣根过氧化酶标记的二抗(1∶1 000)，37 ℃孵育2 h，ECL发光，暗室中显影、定影。采用凝胶图像分析系统分析各蛋白电泳条带灰度值。以β-actin为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。结果显示，GES1细胞、SGC-7901细胞、SGC-7901/DDP细胞c-met蛋白相对表达量分别为1.07±0.02、1.78±0.13、2.88±0.21，三种细胞c-met蛋白相对表达量两两比较P均<0.05。

2.2.3 MDR1 mRNA和P-gp蛋白表达 ①MDR1 mRNA表达：取传3代、对数生长期GES1细胞、SGC-7901细胞和SGC-7901/DDP细胞，采用实时荧光定量PCR法检测MDR1 mRNA表达。引物序列：MDR1上游引物5′-TGAACTGCATACTACGCTCAAGA-3′，下游引物5′-CGGATTCGTCACAATGTGTTC-3′；β-actin上游引物5′-TGGCCCCAGCACAATGAA-3′，下游引物5′-CTAAGAGATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。其余步骤参照2.2.2。结果显示，GES1细胞、SGC-7901细胞、SGC-7901/DDP细胞MDR1 mRNA相对表达量分别为1.02±0.04、2.91±0.21、3.21±0.22，三种细胞MDR1 mRNA相对表达量两两比较P均<0.05。②P-gp蛋白表达：取传3代、对数生长期GES1细胞、SGC-7901细胞、SGC-7901/DDP细胞，采用Western blotting法检测P-gp蛋白表达。一抗为P-gp一抗(1∶1 000)，二抗为辣根过氧化酶标记的二抗(1∶1 000)，其余步骤参照2.2.2。结果显示，GES1细胞、SGC-7901细胞、SGC-7901/DDP细胞P-gp蛋白相对表达量分别为1.05±0.02、1.87±0.13、2.17±0.18，三种细胞P-gp蛋白相对表达量两两比较P均<0.05。

2.3 过表达miR-101对胃癌耐药细胞MDR1 mRNA和P-gp蛋白表达的影响

2.3.1 过表达miR-101的SGC-7901/DDP细胞模型建立 取传3代、对数生长期SGC-7901/DDP细胞，接种于6孔板(内含RPMI 1640培养基)，每孔1×103个，随机分为miR-101 mimic组和阴性对照组，每组设3个复孔。常规培养，待细胞贴壁时，按Lipofectamine2000说明分别转染miR-101 mimic和mimic control。转染48 h，收集细胞，采用实时荧光定量PCR法检测miR-101 mRNA相对表达量。具体步骤参照2.2.1。结果显示，miR-101 mimic组miR-101 mRNA相对表达量为1.85±0.05，阴性对照组0.97±0.04，两组比较P<0.05。表明转染miR-101 mimic能使SGC-7901/DDP细胞miR-101过表达，即成功构建了过表达miR-101的SGC-7901/DDP细胞模型。

2.3.2 过表达miR-101的SGC-7901/DDP细胞MDR1 mRNA和P-gp蛋白表达检测 取2.3.1中两组转染48 h细胞，分别采用实时荧光定量PCR法、Western blotting法检测MDR1 mRNA和P-gp蛋白表达。具体步骤参照2.2.3。结果显示，miR-101 mimic组与阴性对照组MDR1 mRNA相对表达量分别为0.61±0.07、1.12±0.12，P-gp蛋白相对表达量分别为0.31±0.02、0.94±0.03，两组比较P均<0.05。

2.3.3 过表达miR-101的SGC-7901/DDP细胞荧光素酶载体构建与活性检测 利用TargetScan和miRanda在线分析软件预测miR-101的靶向基因c-met，克隆扩增部分c-met 3′-UTR片段：上游引物5′-CTGCAGGCCCACATCTGCCCATGACG-3′、下游引物5′-AGATATCTTTAAAATTGTCATCTGAT-3′。利用NotⅠ和XhoⅠ双酶切产物，并与psiCHECK-2连接。采用Lipofectamine2000将miR-101 mimic和mimic control分别与荧光素酶报告载体共转染SGC-7901/DDP细胞。转染方法：将SGC-7901/DDP细胞接种于24孔板，待细胞融合80%时，将报告基因质粒4 μg与转录因子表达质粒4 μg共转染细胞；转染8 h，按照Dual Luciferase Assay Kit说明进行荧光素酶活性检测。结果显示，miR-101 mimic组荧光素酶活性为0.44±0.03，阴性对照组为1.03±0.08，两组比较P<0.05。

3 讨论

miRNA是一类内源性非编码小分子RNA，通过与目标信使RNA形成RNA诱导的基因沉默复合物，调控相关基因表达，继而参与多种生理和病理学过程。目前研究已证实，miRNA在肿瘤的发生、发展过程中具有重要作用。MacDonagh等[3]研究认为，miRNA可通过调节药物代谢酶在体内的分布和活化程度，继而参与化疗耐药。王中显等[4]报道，miR-199a通过负调控mTOR表达，提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。Wang等[5]研究发现，胃癌耐药SGC-7901/DDP细胞、BGC-823/5-FU细胞miR-17-5p表达上调，其G1期细胞比例明显减少，S期细胞比例明显增多，导致细胞阻滞于G1/S期，诱导胃癌化疗耐药。蔡颖等[6]利用miRNA芯片筛选SGC-7901/ADR及SGC-7901细胞差异表达的miRNA，发现SGC-7901/ADR细胞中miR-103表达下调；进一步研究发现，miR-103可通过靶向负性调控Caveolin-1表达，增加SGC-7901/ADR细胞对多柔比星的敏感性，进而逆转胃癌耐药。以上研究说明，miRNA可能与肿瘤放化疗抵抗密切相关。

miR-101是近年发现的一个肿瘤抑制miRNA，在多种恶性肿瘤组织中表达下调，在肿瘤发生、发展过程中具有类似抑癌基因作用[7]。Guo等[8]报道，通过转染miR-101 mimic或沉默甲基化转移酶3A，卵巢癌SKOV3细胞增殖率和穿膜细胞数明显降低，提示miR-101可能通过负性调控甲基化转移酶3A抑制SKOV3细胞增殖和侵袭。孙海兵等[9]研究发现，胃癌患者血清miR-101水平明显降低，其术后血清miR-101水平明显高于术前，提示血清miR-101有可能作为胃癌诊断的潜在生物学标志物。宋雅琴等[10]报道，胃癌组织miR-101表达下调，且其表达下调与肿瘤TNM分期和淋巴结转移有关，提示miR-101可能对胃癌诊断和预后评估有一定参考价值。近年研究还发现，miR-101低表达可能与多种恶性肿瘤的化疗耐药有关。Tian等[11]报道，替莫唑胺耐药的胶质瘤细胞miR-101表达下调，过表达miR-101可通过抑制糖原合成酶激酶3β逆转替莫唑胺的耐药性。Ye等[12]报道,miR-101可抑制上皮间质细胞转化和靶向调节ROCK2，继而增强非小细胞肺癌细胞对顺铂的敏感性。在急性T淋巴细胞白血病中miR-101发挥抑癌作用，可通过靶向调控Notch1增强化疗敏感性[13]。本研究结果显示，与SGC-7901细胞比较，SGC-7901/DDP细胞miR-101 mRNA表达明显降低，提示miR-101低表达可能与胃癌化疗耐药有关。

P-gp是一种跨膜糖蛋白，可通过与ATP结合将药物从细胞内泵出细胞外，起到“药泵”作用[14]。有研究发现，P-gp高表达的胃癌患者化疗后肿瘤复发率和耐药率明显升高[15]。MDR1属于ATP结合盒转运蛋白超家族成员之一，主要介导恶性肿瘤的化疗耐药[16]。本研究结果显示，SGC-7901/DDP细胞MDR1 mRNA、P-gp蛋白表达明显高于SGC-7901细胞，上调miR-101表达可明显抑制MDR1 mRNA、P-gp蛋白表达，表明miR-101逆转胃癌细胞化疗耐药可能与改变相关耐药基因表达有关。

研究表明，在多种恶性肿瘤组织中c-met表达上调，如前列腺癌、卵巢癌、胃癌等[17～19]。已有研究证实，c-met高表达与肿瘤化疗耐药密切相关，如c-met/PI3K信号通路可介导乳腺癌阿霉素耐药[20]；抑制c-met表达可通过阻断PI3K/Akt通路，增强骨肿瘤对顺铂的敏感性[21]。Fujiwara等[22]研究发现，c-met通过调节下游PI3K/AKT/mTOR信号通路，参与多种肿瘤细胞的生物学行为，如细胞增殖、侵袭和化疗耐药等。本研究结果显示，miR-101可负性调控下游靶基因c-met，说明miR-101可能通过抑制c-met表达逆转胃癌细胞的化疗耐药。

综上所述，胃癌细胞miR-101低表达；miR-101可能通过抑制c-met表达逆转胃癌细胞的化疗耐药。