细胞外酸碱环境对主动脉瓣膜间质细胞钙化的影响及相关机制研究

薛清，李宁，褚恒，刘晓红，韩林，徐志云

主动脉瓣钙化性狭窄是最常见的心脏瓣膜疾病之一，也是导致老年主动脉瓣病变的主要原因［1］。近年来，随着我国人口老龄化进程加剧，主动脉瓣病变发生率呈逐年上升趋势，目前其唯一有效的治疗方法是手术［2］，而如何从发病机制着手进行干预、控制病情进展甚至逆转疾病进程是当前亟待解决的问题。近年来，有关主动脉瓣钙化的基础研究越来越多。第二军医大学附属长海医院心血管外科是全军心脏外科重点实验室，在主动脉瓣钙化相关领域研究较为深入。既往有基础研究结果显示，细胞外酸碱环境对血管平滑肌细胞、成骨细胞等细胞钙化具有明显影响［3-4］。鉴于此，本研究拟通过改变主动脉瓣膜间质细胞培养基的酸碱度来观察瓣膜间质细胞钙化情况，以明确细胞外酸碱环境对主动脉瓣膜间质细胞钙化的影响，并探讨其相关机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主动脉瓣膜 主动脉瓣膜来源于2017年1—6月在第二军医大学附属长海医院心血管外科接受心移植手术的患者，患者均知情并签署知情同意书。取外观正常的主动脉瓣膜备用。

1.1.2 主要试剂 人Ⅱ型胶原酶（Sigma-Aldrich公司），胎牛血清（Gibco公司），DMEM培养基（Gibco公司），青霉素/链霉素双抗液（Gibco公司），0.25%胰蛋白酶（Gibco公司），鼠抗人波形蛋白（Vimentin）抗体（Santa Cruz公司），Alexa Fluor594标记的羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）（Santa Cruz公司），鼠抗人CD31抗体（Santa Cruz公司），Alexa Flour568标记的羊抗鼠IgG（Santa Cruz公司），β-甘油磷酸（Sigma-Aldrich公司），抗坏血酸（Sigma-Aldrich公司），地塞米松（Sigma-Aldrich公司），1 mol/L盐酸溶液（自制），7.4%碳酸氢钠溶液（自制），茜素红（上海生工生物工程股份有限公司），Trizol试剂（Beyotime公司），三氯甲烷（国药集团化学试剂有限公司），异丙醇（国药集团化学试剂有限公司），DEPC处理水（Solarbio公司），PrimeScriptTMRT reagent Kit（TaKaRa 公司），SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa公司），SDS蛋白裂解液（Beyotime公司），PMSF（Beyotime公 司），BCA试 剂 盒（Beyotime公司），彩色预染蛋白质分子量标准（Beyotime公司），SDS-PAGE蛋白上样缓冲液5x（Beyotime公司），SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（Beyotime公司），三羟甲基氨基甲烷（广东金砂化工厂有限公司），十二烷基硫酸钠（广东金砂化工厂有限公司），甘氨酸（广东金砂化工厂），多聚甲醇（国药集团化学试剂有限公司），Western封闭液（Beyotime公司），Western一抗稀释液（Beyotime公司），兔抗人Runt相关转录因子2（Runx2）抗体（Bioworld公司），鼠抗人β-ACTIN抗体（Santa Cruz公司），辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（Bioworld公司），辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（Bioworld公司），超敏ECL化学发光试剂盒（Beyotime公司）。

1.1.3 主要仪器 酸度计（北京时代新维测控设备有限公司），液氮罐（Locator公司），IX70激光扫描共聚焦显微镜（Olympus公司），流式细胞仪（ThermoFisher公司），低温高速离心机（Eppendorf公司），NanoDrop2000分光光度计（ThermoFisher公司），GeneAmp聚合酶链反应（PCR）扩增仪（Applied Biosystems公司），ABI Step One荧光定量PCR仪（Applied Biosystems公司），酶标仪（Princeton公司），蛋白电泳仪（Bio-Rad公司），电泳槽（Bio-Rad公司），PVDF膜（Millipore公司），SX-100凝胶成像分析系统（Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 主动脉瓣膜间质细胞分离和培养 采用二次胶原酶消化法分离主动脉瓣膜间质细胞，具体如下：取正常主动脉瓣膜组织经人Ⅱ型胶原酶消化处理两次后去除组织残渣，剩余液体1 500 r/min离心5 min（离心半径r=168 mm），去上清，底部沉淀即为主动脉瓣膜间质细胞。将细胞重悬后接种于培养板，于培养箱中培养，2 d换液1次，至细胞融合度达到90%～100%传代，取第3～5代细胞备用。

1.2.2 主动脉瓣膜间质细胞鉴定 （1）采用细胞免疫荧光法检测Vimentin，具体如下：4%多聚甲醛固定第3代细胞，0.2% TritonX-100破膜，5%胎牛血清封闭，加鼠抗人Vimentin抗体和Alexa Fluor594标记的羊抗鼠IgG，DAPI复染，显微镜下拍照，其中红色荧光为Vimentin、蓝色荧光为细胞核。（2）采用流式细胞术检测内皮细胞，具体如下：采用0.25%胰蛋白酶消化，1 500 r/min离心5 min（离心半径r=168 mm），去上清重悬；加鼠抗人CD31抗体，1 500 r/min离心5 min（离心半径r=168 mm），去上清重悬；加Alexa Fluor568标记的羊抗鼠IgG，1 500 r/min离心5 min（离心半径r=168 mm），去上清重悬，上机检测。

1.2.3 分组 将传代的瓣膜间质细胞随机分为A、B、C、D 4组，A组使用普通培养基培养，pH值为7.4；B组使用普通培养基+钙化培养基培养，pH值为7.1；C组使用普通培养基+钙化培养基培养，pH值为7.4；D组使用普通培养基+钙化培养基培养，pH值为7.7。普通培养基：10%胎牛血清、DMEM培养基、青霉素/链霉素双抗液；钙化培养基：β-甘油磷酸10 mmol/L、抗坏血酸10 μg/ml、地塞米松10 nmol/L。使用自制盐酸溶液和碳酸氢钠溶液调整培养基pH值。

1.2.4 实时荧光定量PCR 采用实时荧光定量PCR检测细胞骨形态发生蛋白2（BMP-2）、Runx2、碱性磷酸酶（ALP） mRNA表达情况，具体如下：将4组细胞培养7 d，采用Trizol试剂抽提总RNA，反转录为 cDNA，将 cDNA 2 μl、DEPC 处理水 7 μl、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μl、正向引物 0.5 μl、反向引物0.5 μl配制成20 μl反应体系并行定量PCR，PCR反应步骤：pre-incubation：95 ℃（30 s），1个循环；amplification：95 ℃（10 s），60 ℃（20 s），40个循环；Melting Curve：95 ℃（15 s），60 ℃（60 s），95 ℃（60 s），1个循环；Cooling：40 ℃（60 s）1个循环。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。实时荧光定量PCR结果采用ΔΔCt法分析，实验重复3次取平均值。

表1 实时荧光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences of real-time fluorescence quantitative PCR

1.2.5 Western Blot法 采用Western Blot法检测细胞BMP-2、Runx2蛋白表达情况，具体如下：将4组细胞培养7 d，采用SDS蛋白裂解液/PMSF抽提总蛋白，经超声破碎仪辅助裂解，于沸水中煮10～15 min制成蛋白样本；配制SDS-PAGE分离胶、浓缩胶、电泳缓冲液，每组蛋白样本取20 μl进行电泳，湿转法转膜后根据目的蛋白分子量裁剪目的条带和内参条带，Western封闭液封闭1 h，将目的条带和内参条带分别浸没在由Western一抗稀释液、目的蛋白抗体或内参蛋白抗体配制的一抗工作液中，4 ℃摇床摇晃过夜；复温1 h，TBST缓冲液清洗3次，10 min/次，配制二抗工作液并浸没目的条带和内参条带，摇床摇晃1 h，TBST缓冲液清洗3次，10 min/次；将目的条带和内参条带分别置于SX-100凝胶成像分析系统中，滴加超敏ECL化学发光液并拍照；采用Image J软件处理图像，以目的条带灰度值与内参条带灰度值的比值作为蛋白相对表达量，实验重复3次取平均值。

1.2.6 比色法 采用比色法检测细胞ALP活性，具体如下：将4组细胞培养21 d，去除培养基，加入1 ml GENMED清理液，覆盖细胞表面，小心吸除清理液，使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞；再次加入1 ml GENMED清理液，混匀后移至预冷的1.5 ml离心管中，1 200 r/min离心5 min（离心半径r=168 mm），去上清；加入200 μl GENMED裂解液，混匀后移至新的预冷的1.5 ml离心管中，震荡15 s，冰上孵育30 min，13 000 r/min离心5 min（离心半径r=47 mm）；移取500 μl上清液至新的预冷的1.5 ml离心管中，采用BCA法检测蛋白浓度；96孔板依次加入220 μl GENMED缓冲液、25 μl GENMED反应液，37 ℃孵育3 min，分别加入5 μl GENMED清理液或待测样本，置于酶标仪中检测405 nm波长时0 min、5 min读数，并计算ALP活性，ALP活性=〔（待测样本读数-对照样本读数） ×样本稀释倍数×0.25〕/〔0.005×18.5×0.6×5〕/待测样本蛋白浓度，实验重复3次取平均值。

1.2.7 茜素红染色 4组细胞培养21 d后，采用4%多聚甲醛固定10 min，1%茜素红染色10 min，95%乙醇冲洗后显微镜下观察并拍照，其中橘红色结节为钙化结节。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件进行数据处理，计量资料以（x ±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞免疫荧光法检测结果 Vimentin是主动脉瓣膜间质细胞标志物，细胞免疫荧光法检测结果显示，Vimentin阳性率接近100%，见图1。

图1 细胞免疫荧光法检测结果（DAPI复染，×200）Figure 1 Cell immunofluorescence test results

2.2 流式细胞术检测结果 CD31是内皮细胞标志物，流式细胞术检测结果显示，细胞CD31阳性率为1.17%，见图2。

图2 流式细胞术检测结果Figure 2 Flow cytometry results

2.3 细胞BMP-2、Runx2和ALP mRNA表达情况 将A组作为对照，B、C、D组细胞BMP-2、Runx2和ALP mRNA相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；C、D组细胞BMP-2、Runx2和ALP mRNA相对表达量高于B组，D组细胞BMP-2、Runx2和ALP mRNA相对表达量高于C组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

表2 B、C、D组细胞BMP-2、Runx2和ALP mRNA相对表达量比较（x ±s）Table 2 Comparison of relative mRNA expression of BMP-2，Runx2 and ALP in B group，C group and D group

2.4 细胞BMP-2和Runx2蛋白表达情况 4组细胞BMP-2、Runx2蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；B、C、D组细胞BMP-2、Runx2蛋白相对表达量高于A组，C、D组细胞BMP-2、Runx2蛋白相对表达量高于B组，D组细胞BMP-2、Runx2蛋白相对表达量高于C组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表3、图3）。

表3 4组细胞BMP-2和Runx2蛋白相对表达量比较（x±s）Table 3 Comparison of relative protein expression of BMP-2 and Runx2 in the four groups

图3 4组细胞BMP-2、Runx2蛋白电泳结果Figure 3 Protein electrophoretic results of BMP-2 and Runx2 in the four groups

2.5 细胞ALP活性 A组细胞ALP活性为（0.017±0.002）U/mg，B 组为（0.061±0.003）U/mg，C组为（0.105±0.006）U/mg，D组为（0.145±0.005）U/mg。4组细胞ALP活性比较，差异有统计学意义（F=495.40，P＜0.001）；B、C、D细胞组ALP活性高于A组，C、D组细胞ALP活性高于B组，D组细胞ALP活性高于C组，差异有统计学意义（P＜0.05，见图4）。2.6 茜素红染色结果 茜素红染色结果显示，A组细胞钙化结节较少，B、C、D组细胞钙化结节逐渐增多；与C组相比，B组钙化结节明显减少，D组钙化结节明显增多，见图5。

3 讨论

主动脉瓣膜组织由内皮细胞、间质细胞及细胞外基质组成，其中大多数瓣膜组织细胞是间质细胞，其对维持瓣膜正常功能及促进瓣膜疾病发生发展具有重要作用。原代主动脉瓣膜间质细胞悬浮状态时呈圆形或椭圆形，贴壁生长后呈梭形或纺锤形、多角形，表达Vimentin和少量α-平滑肌肌动蛋白。本研究结果显示，第3代细胞Vimentin阳性率接近100%，且内皮细胞含量较低，提示分离、培养出的细胞是主动脉瓣膜间质细胞，且纯度较高，符合体外细胞实验要求。

图4 4组细胞ALP活性比较Figure 4 Comparison of activity of ALP in the four groups

图5 4组细胞钙化结节情况（茜素红染色，×100）Figure 5 Calcified nodules in the four groups

近年来，有关主动脉瓣钙化性狭窄的机制研究较多，主流观点认为瓣膜异位钙化类似成骨，是一个主动的、可逆的病理过程［5］，其中涉及瓣膜内皮细胞和间质细胞转分化、细胞外基质重塑、新生血管形成、血流机械应力改变、脂质浸润、钙磷代谢紊乱、炎症刺激等多个方面［6］，而BMP-2、Runx2、ALP等在瓣膜间质细胞向成骨细胞转分化过程中扮演着重要角色。

骨形态发生蛋白（BMP）是转化生长因子β（TGF-β）超家族重要成员之一，可诱导骨、软骨及骨相关结缔组织形成。BMP-2作为促成骨化最重要的细胞外信号分子，可通过BMP-2/Smads/Runx2/Osterix信号通路参与间质细胞成骨化过程［7］：BMP-2经配体与其受体结合后激活Smads复合物（Smad1、Smad5、Smad8），将信号由细胞膜外传递至细胞核，启动Runx2表达，进而激活下游Osterix，促进细胞成骨化［8］，而Runx2具有调节成骨细胞分化、软骨细胞成熟等作用［9］；除上述BMP-2信号通路处，Runx2还在其他多个信号通路中发挥着促成骨化作用，如Wnt/β-catenin信号通路［10］、Notch信号通路等［11］。既往基础实验已证实，瓣膜间质细胞在钙化培养基作用下向成骨细胞分化时Runx2表达明显升高［12-13］。因此，BMP-2和Runx2可评估瓣膜间质细胞向成骨细胞分化程度［14］。本研究结果显示，C、D组细胞BMP-2、Runx2 mRNA及蛋白相对表达量高于B组，D组细胞BMP-2、Runx2 mRNA及蛋白相对表达量高于C组，提示细胞外酸性环境可抑制主动脉瓣膜间质细胞钙化，而碱性环境则可促进主动脉瓣膜间质细胞钙化，分析其机制可能与细胞外酸碱环境影响BMP-2信号通路有关。

ALP是成骨细胞分化的早期标志物，正常瓣膜间质细胞不存在ALP。既往基础实验证实，在钙化培养基作用下瓣膜间质细胞逐渐成骨化，并表达ALP［15］；ALP活性与钙离子浓度呈正相关，即细胞钙化程度越高则ALP活性越高［16］；ALP抑制剂左旋咪唑可抑制钙化形成［17］。因此，ALP活性与瓣膜间质细胞向成骨细胞分化程度有关［18］。本研究结果显示，C、D组细胞ALP mRNA相对表达量及活性高于B组，D组细胞ALP mRNA相对表达量及活性高于C组，亦提示细胞外酸性环境可抑制主动脉瓣膜间质细胞钙化，而碱性环境则可促进主动脉瓣膜间质细胞钙化。

既往实验结果显示，瓣膜间质细胞在钙化培养基作用下逐渐成骨化，出现钙盐沉积，经茜素红染色呈橘红色结节［6］。本研究结果显示，A组细胞钙化结节较少，B、C、D组细胞钙化结节逐渐增多；与C组相比，B组钙化结节明显减少，D组钙化结节明显增多，再次证实细胞外酸性环境可抑制主动脉瓣膜间质细胞钙化，而碱性环境则可促进主动脉瓣膜间质细胞钙化。

综上所述，细胞外酸性环境可抑制主动脉瓣膜间质细胞钙化，碱性环境则可促进主动脉瓣膜间质细胞钙化，其机制可能与细胞外酸碱环境影响BMP-2信号通路有关，但具体机制尚有待后续实验进一步证实。

作者贡献：薛清、刘晓红、韩林、徐志云进行文章的构思与设计；薛清、李宁、褚恒、刘晓红进行实验实施与可行性分析，结果分析与解释；薛清、李宁、褚恒负责撰写论文；刘晓红、韩林进行论文的修订；韩林、徐志云负责文章的质量控制及审校；韩林对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。

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