1株芘降解酵母菌HXY-5的筛选鉴定及对芘的降解研究

邓 超, 周振宇, 张家傲, 徐梦婷, 张陈齐, 卜 宁

(沈阳师范大学 生命科学学院，辽宁 沈阳 110034)

多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是一类含有两个或两个以上苯环或杂环的有机化学污染物[1-2]，广泛分布于空气、水体、土壤以及植物等环境中，许多PAHs具有持久性、生物积累性以及高生物毒性等特点，可致畸、致癌和致突变，对人类健康和生态环境造成巨大危害[3]。芘是高分子量PAHs的典型代表，具有稳定的分子结构和不易降解性，是检测环境PAHs污染的指示物[4-5]。微生物种类多样且代谢速率高效，是修复治理环境PAHs等有机污染物的有效途径之一[6]。已有的研究表明，许多细菌、真菌等对PAHs都具有降解作用[7]，目前已分离出的PAHs降解菌主要包括假单胞菌属(Pseudomonas)[8]、红球菌属(Rhodococcus)[9]、气单胞菌属 (Aeromonas)[10]、 芽胞杆菌属(Bacillus)[11]、伯克氏菌属(Burkholderia)[12]和分支杆菌属 (Mycobacterium)[13]等。相对于细菌来说，真菌降解PAHs的效率虽然通常高于细菌，在降解高环PAHs方面表现突出，但种类并不多，特别是有关芘降解的酵母菌方面的研究较少。本研究以分离得到的酵母菌为研究对象，探究其对芘的降解情况，为其在环境修复中的实际应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 污染土壤样品 供试土样采自沈抚污灌渠三宝屯区段的污灌底泥。随机选取5个采样点，用抓斗式采泥器分别采集灌渠底泥，将采集的5份土样混匀、分装，于无菌纸袋中4 ℃冰箱保存，备用。

1.1.2 培养基(g/L) 无机盐液体培养基：MgSO4·7H2O 0.5，CaCl20.02，KH2PO41.0，NH4NO31.0，FeCl30.05， pH 6.0；含芘母液：称取芘溶于甲醇溶液中，摇匀使其终浓度为1 g/L；芘无机盐培养基：将用0.22 μm滤膜除菌的含芘母液置于无机盐液体培养基；牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏 3，蛋白胨 10，NaCl 5，琼脂 20，pH 6.0；PDA培养基：马铃薯 200，蔗糖 20，琼脂 20，pH自然；PDB培养基：马铃薯 200，蔗糖 20，pH自然。

1.1.3 主要试剂 芘，纯度98%，Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 污染土壤悬液的制备 将供试土壤样品1 g加入装有玻璃珠并含有99 mL无菌水的250 mL锥形瓶中，25 ℃、175 r/min振荡2 h制成土壤悬液，待静止沉淀2 h后，取上清液作为菌源。

1.2.2 芘降解菌的富集、分离纯化 将制备的菌源接入到50 mL以芘为唯一碳源的无机盐液体培养基中，芘初始质量浓度为50 mg/L，25 ℃、175 r/min富集培养7 d，取第一次富集培养液以10%体积比转接到新的含芘无机盐液体培养基中，进行第二次富集培养，如此反复4次，每转接1次，芘质量浓度依次调整为50、100、150、200、300 mg/L。将经5次富集后的培养液稀释并分别涂布于牛肉膏蛋白胨培养基和PDA培养基上，25 ℃培养，挑取不同菌落形态的单菌落，采用平板划线法进行分离纯化。将分离纯化的菌株分别转接于相应的斜面培养基，培养后于4 ℃冰箱保存、备用。

1.2.3 HXY-5菌株的鉴定 ①HXY-5菌株的形态学鉴定：a.细胞个体形态观察：光学显微镜下观察细胞个体形态。b.菌落形态观察：将筛选出的HXY-5菌种接种于50 mL的PDB培养基中25 ℃、175 r/min摇床培养，活化24 h。接种活化后的HXY-5菌株于PDA培养基中涂布，25 ℃倒置培养数天，观察菌落形态。②HXY-5菌株的分子生物学鉴定：用真菌基因组快速提取试剂盒提取HXY-5菌株的基因组DNA。以菌株HXY-5的基因组为模板，以18S-ITS1和18S-ITS4为引物，采用20 μL PCR反应体系进行PCR扩增。扩增产物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行同源性序列分析与比对。根据测序结果构建系统发育树。

1.2.4 HXY-5菌株的培养条件优化 ①不同培养时间对菌株生长的影响：将1 mL活化后的菌液，分别加入到含有50 mL PDB培养基的100 mL锥形瓶中，25 ℃、175 r/min摇床培养，间隔4 h取出一组，0～40 h共11组。每组做3个平行。②初始 pH对菌株生长的影响：将1 mL活化后的菌液，分别加入到含有50 mL PDB培养基的100 mL锥形瓶中，PDB培养基的初始pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，25 ℃、175 r/min摇床培养24 h，每组3个平行。③不同碳、氮源对菌株生长的影响：在无机盐培养基中分别加入2%的葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖，以不加碳源为对照，接种0.5 mL HXY-5菌株母液，25 ℃、175 r/min培养24 h，测定菌体浓度，每组处理设3个重复，以筛选最佳碳源；用相同方法在无机盐培养基中加入2%的牛肉膏、蛋白胨、氯化铵、硫酸铵、硝酸钠为供试氮源，以不加氮源的培养基为对照，筛选最佳氮源。④正交试验设计：以最佳碳源(蔗糖和甘露醇)、最佳氮源(酵母浸粉)、MgSO4·7H2O、CaCl2、KH2PO4和FeCl3七个因素设计7因素4水平正交试验，测定HXY-5菌株的最优培养条件。

表1 正交试验因素与水平

1.2.5 HXY-5菌株对芘降解的研究 ①芘标准曲线的测定：取0.1 g芘溶于甲醇中，定容至100 mL，利用分光光度计在270～600 nm范围内测定芘标准溶液的最高吸收峰。取0.2 g芘溶于甲醇中，定容至250 mL，再取配制好的溶液分别稀释2、4、8倍，配制浓度分别为0.8、0.4、0.2、0.1 mg/mL，在紫外分光光度计下测定其OD600值[14]。②不同芘浓度对 HXY-5菌株降解芘的影响：将1 mL活化后的菌液，分别加入到含有50 mL 无机盐培养基的100 mL锥形瓶中，其初始芘浓度分别为0、50、100、200、400 mg/L，25 ℃、175 r/min摇床培养15 d。每组3个平行，以空白培养基对为照。③不同培养时间对 HXY菌株降解芘的影响：将1 mL活化后的菌液，加入芘浓度为100 mg/L的含有50 mL无机盐培养基的100 mL锥形瓶中，25 ℃、175 r/min摇床培养15 d，分别于第3、6、9、12和15天取出3瓶，用紫外分光光度计测定芘的浓度[8]。每组3个平行，以空白培养基为对照。

芘降解计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 HXY-5菌株的形态学鉴定

HXY-5细胞形态见图1。由图1可见，光学显微镜下细胞呈圆形或椭圆形，细胞内可见明显的大液泡，细胞大小(1.0～4.7)μm×(0.8～4.0)μm，可出芽生殖。HXY-5菌落形态见图2。由图2可见，HXY-5菌株在PDA平板培养基上的菌落呈乳白色，不透明，菌落边缘整齐，表面光滑较粘稠，易挑取，菌落正反面颜色相同。

图1 HXY-5菌株的细胞形态Fig.1 Cell morphology of HXY-5 strain

图2 HXY-5菌落形态Fig.2 HXY-5 colonies morphology

2.2 HXY-5菌株的分子生物学鉴定

HXY-5菌株的18S rDNA序列经BLAST对比，可鉴定该菌株为间型假丝酵母(Candidaintermedia)，基因同源性相似度达99%。MEGA6.0构建菌株的系统进化树见图3。

2.3 HXY-5菌株培养条件的优化

2.3.1 不同培养时间对菌株生长的影响 由图4可知，0～24 h内OD600值随培养时间的增加而加大，菌数呈指数增长，在24 h时达到最大；24 h以后，OD600值随培养时间的增加而减少，菌数不再增加，整个群体生长进入稳定期、衰亡期。

2.3.2 初始 pH对菌株生长的影响 由图5可知，pH为3.0～6.0时，菌体数量随着初始pH的增大而加大，菌数呈指数增长，pH为6.0时达到最大；pH 6.0～9.0时，菌体数量随着初始pH的增大而减少。

2.3.3 不同碳、氮源对HXY-5菌株生长的影响 由于酵母菌菌体较大，故采取光电比浊法计算该菌株的浓度。从图6、7中数据可以看出，该菌株在以蔗糖或甘露醇为碳源时生长情况相似，酵母浸粉为氮源时生长情况最好。

2.3.4 HXY-5菌株培养基优化 根据单因素试验结果，以蔗糖、甘露醇为碳源，酵母浸粉为氮源，同时选取MgSO4·7H2O、CaCl2、KH2PO4、FeCl3设计7因素4水平正交试验，结果见表2。

图3 基于18S rDNA序列构建的HXY-5系统进化树Fig.3 HXY-5 phylogenetic tree based on 18S rDNA sequences

试验号蔗糖/(g·L-1)甘露醇/(g·L-1)酵母浸粉/(g·L-1)MgSO4·7H2O/(g·L-1)CaCl2/(g·L-1)KH2PO4/(g·L-1)FeCl3/(g·L-1)OD60011040100.02200.7392102000.250.0210.10.55530100.500.0420.050.9294401000.250.01200.524520100.510.0100.10.9816402000.500.50.050.58971000.50.5020.11.1968040010.0110.050.54494010200.020.50.0251.133

续表2

根据R值大小可得各因素作用的主次顺序为氮源(酵母浸粉)>无机盐(硫酸镁)>无机盐(氯化钙)>碳源(蔗糖)>碳源(甘露醇)>无机盐(磷酸二氢钾)>无机盐(三氯化铁)。由上述无机盐培养基正交试验结果中的各列K值可知：碳源蔗糖的最适浓度为20 g/L，碳源甘露醇的最适浓度为20 g/L，氮源酵母浸粉的最适浓度为2 g/L,硫酸镁的最适浓度为0.5 g/L,氯化钙的最适浓度为0.01 g/L，磷酸二氢钾的最适浓度为0.5 g/L，三氯化铁的最适浓度为0.025 g/L。

由测定结果可知，HXY-5菌株最佳培养基的配方(g/L)：蔗糖20， 酵母浸粉2， MgSO4·7H2O 0.5，CaCl20.01，KH2PO40.5。

2.4 HXY-5菌株对芘的降解作用

2.4.1 芘的标准曲线 用1.0、2.0、3.0 mg/L的芘标准溶液测定紫外吸收光谱，得到芘标准溶液在320 nm处有最高吸收峰。在波长320 nm处测得芘标准溶液在0.1～0.8 mg/L 的范围内呈良好线性关系，见图8。

图4 HXY-5菌株生长曲线Fig.4 HXY-5 strain growth curve

图5 初始pH对HXY-5菌株生长的影响Fig.5 Effect of initial pH on the growth of HXY-5 strain

图6 不同碳源对HXY-5菌株生长的影响Fig.6 Effect of different carbon sources on the growth of HXY-5 strain

图7 不同氮源对HXY-5菌株生长的影响Fig.7 Effect of different nitrogen sources on the growth of HXY-5 strain

图8 芘的标准曲线Fig.8 Standard curve of pyrene

2.4.2 HXY-5菌株对芘的降解 HXY-5菌株在芘浓度为0～400 mg/L时的生长状况见图9。由图9可知，当芘浓度为100 mg/L时，菌株的生长情况最好，芘在第3、6、9、12、15天降解率分别为8%、20%、32%、46%和63%。

图9 不同芘浓度对HXY-5菌株生长的影响Fig.9 Effect of pyrene concentration on the growth of HXY-5 strain

3 讨 论

从被石油严重污染的污灌渠底泥中分离得到芘降解菌HXY-5，经形态学和分子生物学鉴定其为间型假丝酵母(Candidaintermedia)。该菌株的优化培养条件为蔗糖20 g，酵母浸粉2 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.01 g，KH2PO40.5 g，初始pH 6.0， 25 ℃培养24 h。在芘浓度为100 mg/L时，该菌株对芘的降解效果明显，培养15 d时芘降解率可达63%。

对HXY-5酵母菌的光学显微镜观察显示，其细胞内具较大液泡，但其液泡内却具有一可见的杆状物质，且在活体细胞内呈较活跃的运动状，其对低浓度美蓝的着色情况与活体酵母菌相同。该杆状物是否与芘的降解有关，有待进一步的研究。

利用微生物修复自然环境中PAHs污染是污染治理的关键，因其具有费用低、二次污染少、修复彻底等优点，现已成为较高效、安全的生物修复技术[15-17]。本研究从HXY-5菌株生长条件入手，探究了HXY-5菌株对芘的降解作用。研究表明，该菌株对芘的降解效果良好。对HXY-5菌株的研究，有利于进一步探究该菌株的生物学价值，探究该菌株在石油污染环境下生存的意义，并为治理芘污染提供高效、低消耗的可能。

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